缺血性心脏疾病依然是世界范围内引起死亡的最主要疾病,并且呈现逐年快速增加的趋势。据欧洲统计学数据显示,缺血性心脏疾病每年导致180万患者死亡,占欧洲总死亡病例数的20%,其巨大的危害不言而喻。心脏功能衰竭是急性心肌梗死后最常见、也是最为人知的并发症,在过去的三十年时间里,随着科学技术的不断进步和心脏治疗技术的广泛开展,如经皮冠状动脉介入治疗、介入性药物治疗等手段,使急性心肌梗死的死亡率逐渐呈现下降趋势,有效遏制了心肌梗死后心脏功能衰竭等众多并发症的发生。心脏功能衰竭常常伴随着严重的左心室重构,最终表现为心室腔扩张和心脏功能障碍。研究数据显示:2010年,在因急性心肌梗死引发心脏功能衰竭而住院的患者中,1年死亡率仍然高达45.5%。该数据自2007年以来一直保持增加趋势,严重危害患者生命健康。2013年,中国的人群调查数据显示,慢性心脏功能衰竭的发生率已经高达0.9%,但是目前仍然缺乏有效的治疗方法。心肌梗死后心脏功能衰竭的发生发展过程十分复杂,有研究报道显示,心肌细胞坏死、过多的心肌细胞凋亡、各类细胞因子的分泌、心脏内部纤维化以及梗死区域非心肌细胞增生导致的的心脏力学变化等都在心肌梗死后心脏功能衰竭的发生发展过程中起着重要的作用。自噬作为机体一种高度保守的生理过程,在机体的病理生理过程中发挥着十分重要的作用。自噬可以监控细胞器的功能及蛋白质的质量,当机体受到有害刺激,导致细胞器受损或蛋白质折叠错误时,可以通过自噬途径进行降解,使能量物质得到重复利用,维持机体动态平衡。许多研究都证实自噬过程在众多心脏疾病中发挥重要的保护作用,自噬不足会造成心肌功能受到损伤,导致心脏功能障碍。Mst1(哺乳动物STE20样激酶1),是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,同时也是Hippo通道的关键分子,具有许多重要的生理功能,如调控自噬、凋亡,控制器官大小等。在心脏中,持续激活的Mst1会导致扩张型心肌病。然而,抑制内源性的Mst1活性可以保护心脏功能,此外,激活的Mst1还可以通过抑制自噬导致小鼠心肌梗死后心脏功能恶化。抑瘤素M(OSM)是一种具有多种生理学功能的促炎症因子,属于白介素-6家族的一员。我们的前期研究显示,在糖尿病条件下,OSM可以通过其Oβ受体,调控凋亡、胰岛素敏感性以及线粒体合成等过程,改善心脏缺血/再灌注损伤。但是,OSM是否可以改善心肌梗死后心脏功能,其具体机制到目前仍不清楚。本实验旨在探究OSM是否可以通过调控自噬过程改善心肌梗死后心脏功能及其可能的机制,为心肌梗死后心力衰竭的治疗方法提供坚实的科学研究基础。【目的】1.在动物实验中,通过构建心肌梗死模型,探索OSM是否可以改善心肌梗死后心脏功能。2.在细胞实验中,通过分离、培养原代心肌细胞,利用缺氧环境,体外模拟心肌梗死模型,利用自噬检测工具,如GFP-LC3腺病毒以及巴弗洛霉素A1等探究OSM对于缺氧后心肌细胞自噬流水平的影响。3.探究OSM是否通过其Oβ受体发挥心肌保护作用。构建Oβ受体敲除小鼠,观察OSM处理对于Oβ受体敲除小鼠及同窝对照小鼠心肌梗死后心脏功能及心脏重构的影响。4.通过构建Mst1敲除及转基因小鼠,观察OSM处理对其心肌梗死后心脏功能的影响,探究OSM/Oβ/Mst1信号通路在心肌梗死后心脏功能中的作用。【研究方法】1.将C57BL/6背景的小鼠随机分入以下实验小组:A.假手术组(Sham)B.心肌梗死组(MI)C.心肌梗死+OSM处理组(MI+OSM)2.通过结扎小鼠冠状动脉前降支成功构建心肌梗死动物模型。在构建心肌梗死模型前,以腹腔注射的方式给予小鼠OSM处理,每天2次,连续给予14天,小鼠心肌梗死后心脏功能通过小动物心脏超声进行检测。3.心肌梗死4周后收集小鼠心脏组织,通过马松染色的方法检测心脏重构情况。4.心肌梗死4周后收集小鼠心肌组织,通过透射电子显微镜观察小鼠心肌组织超微结构的变化。5.体外分离、培养原代心肌细胞,运用缺氧培养箱体外模拟心肌梗死条件。原代心肌细胞随机分入以下实验小组:A.对照组(CON)B.缺氧组(H)C.缺氧+OSM处理组(H+OSM)6.为了检测心肌细胞缺氧后自噬水平,在心肌细胞给予OSM处理及缺氧处理之前,转染GFP-LC3腺病毒(MOI:80:1),在共聚焦显微镜下观测自噬小体数目并作后续分析。7.在生理条件下,自噬可以降解错误折叠的蛋白质及受损的细胞器。我们通过p62与蛋白聚集体共定位染色的方法间接检测心肌细胞自噬水平。在经过48h OSM处理及8h缺氧处理后,运用p62特异性的一抗及对应的荧光二抗进行免疫荧光染色,蛋白聚集体通过特异的试剂盒进行染色。在共聚焦显微镜下观察并作后期统计学分析。8.Oβ受体敲除及同窝对照小鼠随机分入以下实验组:A.Oβ受体敲除假手术组(Oβ-/-Sham)B.Oβ受体敲除心肌梗死组(Oβ-/-+MI)C.Oβ受体敲除心肌梗死+OSM处理组(Oβ-/-+MI+OSM)D.同窝对照假手术组(Oβ+/+Sham)E.同窝对照心肌梗死组(Oβ+/++MI)F.同窝对照心肌梗死+OSM处理组(Oβ+/++MI+OSM)9.原代心肌细胞通过转染Oβ短发夹RNA腺病毒(Ad-sh-Oβ),将原代心肌细胞Oβ基因敲低,随后同阴性对照腺病毒(Ad-Lac Z)转染原代心肌细胞分入以下实验小组:A.Oβ基因敲低组(Ad-sh-Oβ)B.Oβ基因敲低+缺氧组(Ad-sh-Oβ+H)C.Oβ基因敲低+缺氧+OSM处理组(Ad-sh-Oβ+H+OSM)D.阴性对照组(Ad-Lac Z)E.阴性对照+缺氧组(Ad-Lac Z+H)F.阴性对照+缺氧+OSM处理组(Ad-Lac Z+H+OSM)10.Mst1转基因(Mst1Tg),Mst1敲除(Mst1-/-)及Mst1转基因:Oβ受体敲除(Mst1Tg:Oβ-/-)小鼠随机分入以下实验小组:A.Mst1敲除假手术组(Mst1-/-Sham)B.Mst1敲除心肌梗死组(Mst1-/-+MI)C.Mst1敲除心肌梗死+OSM处理组(Mst1-/-+MI+OSM)D.Mst1转基因假手术组(Mst1Tg Sham)E.Mst1转基因心肌梗死组(Mst1Tg+MI)F.Mst1转基因心肌梗死+OSM处理组(Mst1Tg+MI+OSM)G.Mst1转基因:Oβ受体敲除心肌梗死+OSM处理组(Mst1Tg:Oβ-/-+MI+OSM)11.体外培养的原代心肌细胞通过转染Mst1短发夹RNA及Mst1 c DNA(Ad-sh-Mst1,Ad-Mst1)达到敲低和过表达Mst1基因的目的,和转染携带Oβ短发夹RNA的腺病毒敲低Oβ基因。将原代心肌细胞分为以下实验小组:A.Mst1基因敲低组(Ad-sh-Mst1)B.Mst1基因敲低+缺氧组(Ad-sh-Mst1+H)C.Mst1基因敲低+缺氧+OSM处理组(Ad-sh-Mst1+H+OSM)D.Mst1基因过表达组(Ad-Mst1)E.Mst1基因过表达+缺氧组(Ad-Mst1+H)F.Mst1基因过表达+缺氧+OSM处理组(Ad-Mst1+H+OSM)G.Mst1基因过表达+Oβ基因敲低+缺氧+OSM处理组(Ad-Mst1+Ad-sh-Oβ+H+OSM)12.心肌梗死模型构建4周后,收集心肌组织并用RIPA裂解液提取组织蛋白。原代心肌细胞在OSM处理及缺氧后被裂解提取蛋白,运用Western blotting技术检测各信号通路分子表达情况。13.经过OSM处理及缺氧处理后,运用TUNEL染色的方法检测心肌细胞凋亡。在共聚焦显微镜下观察TUNEL阳性心肌细胞,后期统计分析心肌细胞凋亡率。14.使用JC-1染色方法检测原代心肌细胞缺氧后线粒体膜电位的高低。【研究结果】1.在心肌梗死条件下,OSM处理可以显著改善小鼠心肌梗死后心脏功能、延缓左心室重构。2.OSM处理可以显著促进原代心肌细胞缺氧后自噬水平,同时抑制p62/蛋白聚集体的聚集,此外,OSM可以显著抑制Mst1的磷酸化水平。3.通过运用3-MA抑制自噬水平,OSM不能发挥心肌梗死后心脏功能保护作用,说明OSM通过促进心肌自噬发挥心脏功能保护作用。4.Oβ受体敲除之后,OSM改善小鼠心肌梗死后心脏功能的作用消失,提示OSM通过其Oβ受体发挥心脏保护作用。5.OSM通过其Oβ受体促进缺氧后心肌细胞自噬流的水平。6.Mst1敲除之后,OSM不能进一步改善心脏功能、延缓心脏重构,不能进一步促进心肌自噬流。7.OSM显著改善Mst1转基因小鼠心肌梗死后心脏功能,促进Mst1基因过表达心肌细胞缺氧后自噬流的水平。【结论】本项研究数据显示,OSM通过OSM/Oβ/Mst1信号通路上调心肌自噬水平,改善心肌梗死后心脏功能,延缓心脏重构。因此,OSM/Oβ/Mst1信号通路可能作为治疗心肌梗死后心力衰竭的有效靶点。