【摘 要】
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猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和猪肠道α冠状病毒(PEAV)是两种新发现的猪传染性冠状病毒,临床上均以腹泻为主,伴有呕吐等症状,临床症状相似,各年龄段猪均可感染,幼龄仔猪死亡率高达100%,给养猪业造成巨大的经济损失。本研究旨在建立一种快速、准确区分PDCoV和PEAV的二重RT-PCR方法;对广西壮族自治区部分地区猪腹泻样品进行PDCoV和PEAV检测,探究两种病毒遗传变异及流行现状;针对PDC
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猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和猪肠道α冠状病毒(PEAV)是两种新发现的猪传染性冠状病毒,临床上均以腹泻为主,伴有呕吐等症状,临床症状相似,各年龄段猪均可感染,幼龄仔猪死亡率高达100%,给养猪业造成巨大的经济损失。本研究旨在建立一种快速、准确区分PDCoV和PEAV的二重RT-PCR方法;对广西壮族自治区部分地区猪腹泻样品进行PDCoV和PEAV检测,探究两种病毒遗传变异及流行现状;针对PDCoV和PEAV的N蛋白抑制I型IFN产生的机制进行研究。根据PDCoV和PEAV N基因序列,分别设计特异性引物,以阳性质粒为模板,对二重RT-PCR反应条件优化后进行特异性、敏感性试验;对2017-2018年,采集自广西壮族自治区62份肠道和腹泻样品进行检测,阳性样本进行RT-PCR分段扩增,拼接获得PDCoV全基因组全长。以PDCoV和PEAV基因组为模板,构建N基因真核表达质粒,转染HEK-293T细胞,通过q PCR证实PDCoV和PEAV N蛋白抑制IFN-β的产生,并通过Western blot、Co-IP等实验方法验证具体作用机制。建立的PDCoV和PEAV二重RT-PCR检测方法扩增出PDCoV和PEAV的特异性片段大小分别为690bp和208bp,且对PEDV、TGEV、PRV和PCV2无扩增条带;对PDCoV和PEAV的最低检测率分别为5.13×10~2copies/μL、4.73×10~1copies/μL。62份样品中PDCoV阳性率为19.4%(12/62),PEDV、TGEV和Po RV阳性率分别为32.3%(20/62)、4.8%(3/62)、6.5%(4/62),未检测到PEAV。5株全基因组序列分析显示在非结构蛋白Nsp2、Nsp3分别存在6碱基和9碱基缺失,并且CHN-GX81-2018毒株在S基因和3’-UTR没有基因缺失和插入现象。遗传进化分析表明其中4株与CHN-AH-2004的核苷酸同源性为98.2%-98.4%,属于中国谱系。CHN-GX81-2018毒株与Vietnam/Binh21/2015的核苷酸同源性为98.7%,属于越南/老挝/泰国谱系。PDCoV和PEAV的N蛋白均能抑制Poly I:C刺激的IFN-β的产生。进一步研究发现PDCoV和PEAV N蛋白通过与RIG-I相互作用,抑制RIG-I的泛素化修饰,同时抑制下游信号通路中的IRF3和p65(NF-κB亚基)的磷酸化,从而抑制IFN-β的产生。
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