论文部分内容阅读
卵母细胞成熟过程中积累了大量的母源因子,它们在胚胎发育的早期事件中起着极其重要的调节作用,这些早期事件包括卵细胞激活、合子基因组转录活化等。我们所关注的卵细胞激活过程包括减数分裂的完成、原核的形成以及细胞骨架的重组,该过程的完成几乎完全依赖于母源蛋白和mRNA在稳定性和翻译水平的调控。本实验室在前期工作中,利用二维电泳和质谱的方法建立了孤雌激活前后小鼠卵细胞的蛋白表达谱以及激活前小鼠卵细胞蛋白磷酸化表达谱,通过比对筛选出一批有价值的差异表达的母源蛋白,PCBP1就是其中之一,它在激活前后蛋白总量没有显著改变,但是激活后发生了去磷酸化。PCBP1（poly（rc）binding protein 1）蛋白属于核酸结合蛋白超家族,含有3个保守的KH结构域以及多个磷酸化位点。在真核细胞中,PCBP1蛋白一方面主要通过其KH结构域与mRNA 3’-UTR的CU-rich元件（（CyU）CCANxCCC（UyA）PyxUC（CyU）CC）相结合,调节mRNA的稳定或翻译,而且去磷酸化后它与mRNA结合活性增强;另一方面它也可以通过蛋白-蛋白相互作用发挥相应的生物学功能。本课题中我们首次研究和探讨了PCBP1蛋白在小鼠卵细胞激活和早期胚胎发育中的功能。我们首先根据PCBP1蛋白的作用机制,利用文献检索以及生物信息学手段分析得到,在小鼠卵细胞中可能存在一系列受PCBP1蛋白调节其稳定性的mRNA以及与PCBP1发生相互作用的蛋白,其中H2A.X mRNA和Lamin A/C蛋白引起了我们的浓厚兴趣。H2A.X是组蛋白H2A家族的一员,其mRNA 3’-UTR含有CU-rich元件。它主要参与核小体聚集、染色体组装、DNA修复等过程。爪蟾卵中研究证实磷酸化的H2A.X与受精后精子染色质去浓缩进而形成雄原核的过程密切相关。Lamin A/C,即核纤层蛋白A/C,它表达于各种有核细胞的核膜和核质中,与核膜聚集和分布、染色质组装相关,是核重组装和原核形成的一个潜在的标记蛋白。在脑组织中研究发现它与PCBP1可以发生蛋白-蛋白相互作用。因此我们推测小鼠卵细胞中PCBP1是否可能通过调节H2A.X mRNA稳定性进而调节其蛋白表达或者通过与Lamin A/C蛋白发生相互作用来参与胚胎发育早期事件中的原核形成过程。为了证实该猜想,我们首先运用Western blot验证了二维电泳的结果,证实了PCBP1蛋白在小鼠卵细胞中的表达;小鼠卵巢免疫组化和卵细胞免疫荧光结果提示,在MⅡ期卵细胞中,PCBP1蛋白弥散分布于胞浆,而在孤雌激活或正常受精的1细胞合子中则定位于核膜及核质中。MⅡ期卵细胞胞浆内PCBP1抗体注射或者RNAi实验发现,阻断该蛋白的活性或表达后原核形成明显延迟。进一步机制研究中利用小鼠卵细胞胞浆内H2A.X抗体注射,发现原核形成明显延迟,表明H2A.X的确参与了小鼠卵细胞激活后的原核形成过程,并且RT-PCR检测到PCBP1抗体注射后卵细胞中H2A.X mRNA的水平显著下降,证实了PCBP1蛋白在小鼠卵细胞中能够调节H2A.X mRNA的稳定性;免疫荧光双染也发现,PCBP1和Lamin A/C共定位于孤雌激活或者正常受精的1细胞合子的核膜和核质中,提示在小鼠卵细胞中PCBP1也可能通过和Lamin A/C相互作用参与原核形成。此外我们还进行了原核注射超表达PCBP1,发现胚胎始终停滞于1细胞期,并且胞浆中出现了类似原核状结构。综上所述,我们初步得出结论,PCBP1蛋白至少可以通过以下两条途径参于原核的形成:1.卵细胞激活后母源蛋白PCBP1发生去磷酸化,与H2A.X mRNA的结合活性增强,促进了H2A.X mRNA的稳定及其蛋白表达,从而参与原核形成;2.卵细胞激活后,PCBP1蛋白与新合成的Lamin A/C相互作用,参与核和染色质的重组装,从而促进原核形成。本研究工作的开展能够帮助我们更好地理解原核形成的机制,了解早期体外培养胚胎和核移植胚胎发育失败的原因,为提高体外培养和核移植胚胎发育的成功率提供理论基础。