前言 重金属是人体所必需的微量元素，需要维持严格的恒常性，其中铜是体内很多酶的辅因子，能激活各种酶。但是也具有毒性，铜可以与一些脂质，蛋白质和核酸等物质高亲和性地结合，并催化其氧化，所以维持铜浓度在一定的正常范围很重要。机体有很多严格的维持铜浓度的调节机制，如果这些机制因为某些原因不能正常运行，将会导致铜的过剩或缺乏，引起各种疾病。其中研究最多的是铜代谢异常所引起的wilson’s病，这种病是常染色体隐性遗传病，如果肝脏中铜浓度达到毒性水平，将引发急性肝炎，其发生率为三万分之一。而且由受损的肝脏排出来的铜沉积在脑、视网膜等组织，导致这些组织的功能障碍。铜从肝脏的分泌和排泄需要肝细胞内高尔基体的铜转运蛋白ATP7B，wilson’s病患者这种蛋白缺陷，所以铜向肝外分泌和排泄减少，铜沉积在肝脏中，导致肝损害。 现在已经知道维持细胞内铜浓度的几种蛋白(例如ATP7B)，但是关于调节铜从肝脏排泄到胆汁过程的蛋白质的研究很少。体内的铜代谢主要在肝脏进行，铜排泄主要途径有分泌到血液中和排泄到胆汁中两种，其中从高尔基体通过溶酶体分泌到胆汁中的铜占摄取到肝细胞内铜的3/4，目前还没有研究发现关于此途径的与铜具有亲和力的蛋白质。因此发现与此途径相关的蛋白质对于揭示肝脏铜排泄途径的机制，将具有一定意义。 实验材料和方法 本实验采用肝脏灌流技术和一系列离心得到10周龄wister雄性大鼠的溶酶体成分，再利用分子排阻层析和铜结合层析等方法，分离得到与铜离子具有亲和性的蛋白质。通过SDS-PAGE和H叶兀得到可进行氨基酸测序的肽段，进一步进行氨基酸序列测定与分析。 1．通过10周龄ister大鼠的肝脏灌流，匀浆和一系列离心得到溶酶体成分。 2．通过G－25层析和铜结合层析纯化大鼠肝脏溶酶体中与铜具有亲和性的蛋白质。 3．SDS－PAGE分析得到3条主要蛋白带，剪下这三条带进行胶内赖氨酸内切酶的消化，通过高效液相色谱分离肽段，选择性进行肽段的氨基酸序列测定。 4．用分子量在58KD的蛋白质免疫家兔，得到多克隆抗体。 实验结果 1．经上述的处理和分析，大鼠肝脏溶酶体中铜结合蛋白质（分子量58KD）与哺乳动物蛋白质无同源性。 2．免疫家免得到了兔抗大鼠钢结合蛋白质的多克隆抗体。 讨 论 近年来的研究发现了多种在不同生物种系维持细胞内钢平衡的蛋白，这些蛋白分布较广，从噬菌体到人类都存在具有这种功能的蛋白质，分为铜伴侣和铜转运体两种。铜伴侣的作用是结合并运输铜至细胞质内的特异性器官或靶蛋白，可以阻止不适合的结合；而钢转运体是细胞的膜肉蛋白，可调节细胞对铜的摄取和排泄。这些铜伴侣和铜转运体的发现给我们提供了关于铜代谢有用的信息，因此找出这些过程中的一些新蛋白将有助于揭示各种细胞内铜代谢途径。人类的两种钢转运体的发现对于我们了解和解释 Wilson’s病和．Menkes病的致病机制做出了巨大的贡献。人类的铜伴侣有HAHI，hCCS，hcoxl7，ATOXI等，铜转运体包括h－tri，AITpoA，ATP7B等。铜的摄取由钢转运体完成，不同的生物种 ·2·系有不同的转运体，例如 En．F［irae的 CoPA，酵母的 Ctrl，人类的h出 等等。由这些钢转运体摄取进来的铜，在细胞质内与铜伴侣结合，运输到铜的分泌系统，再由其他转运体，例如 En．Hirae的COPB，酵母的CCCZ，人类的ATP7A和ATP7B等分泌到细胞外。铜等人体必需重金属做为各种金属酶的辅因子起着重要的作用，这些金属酶包括细胞色素C氧化酶，过氧化歧化酶，赖氨酸氧化酶等，分别起着线粒体呼吸链中递电子，保护生物大分子不被自由基氧化，细胞胶原蛋白和弹性蛋白的交连等作用。但是过量或过少就会引起一些疾病，最典型的是隐性遗传病Wilson’s病和Menkes病。因此研究体内铜平衡的机制即如何摄取和分泌发泄；并发现和研究相关蛋白质具有重大的意义。铜代谢主要器官是肝脏，摄取到肝细胞中的3／4以上的铜都是通过胆汁途径排泄到小肠中，关于这个途径的蛋白质的研究非常少，毫无疑问新蛋白的发现将对进一步揭示肝脏中铜代谢过：程起着重要的作用。Irene等人的研究表明钢结合蛋白具有高度同源性的钢结合氨基酸序列，从酵母等低等动物到真核细胞N末端都有MXCXXC X代表任意氨基酸厂是钢结合的区域，例如 AI”o B的 N末端就有 5个 MXC状C结构，实验也证明一摩尔的蛋白质可与5摩尔的硫酸铜结合。我们纯化的钢结合蛋白到底有没有这种钢结合部位，具有什么样的理化性质，及其基因水平的表达调控机制有待我们继续研究，这将是揭示肝脏中铜经胆汁途径排泄机制的重要的一步。 结 论 二．认为从大鼠肝脏溶酶体中分高纯化得到的蛋白质是一种新的蛋白质。 2．这种蛋白质具有抗原决定簇，能免疫家兔并产生多克隆抗体。