人类白细胞抗原(humanleukocyteantigen,HLA)G基因是1987年由Geraghty等克隆并测序的一类非经典HLA I类基因,可通过不同的剪切方式翻译出七种不同结构的蛋白,包括4种跨膜型和3种可溶性HLA-G(soluble HLA-G,sHLA-G)分子。对HLA-G的关注源于母胎耐受。胎儿基因组的一半来自父方,这些基因编码的产物对母体而言是同种异体抗原,但正常情况下母体并不对胎儿的同种异体抗原产生免疫应答而导致对胎儿的排斥。因此,母胎之间必然存在诱导并维持母胎耐受的机制。研究发现,胎盘绒毛膜细胞不表达经典的HLA I、II类分子,却表达非经典的HLA-G分子。母胎界面上HLA分子表达的特殊性是导致母胎耐受的重要机制之一。对HLA-G的研究最初集中于跨模型HLA-G1分子。研究证实,跨膜型HLA-G1分子可直接或间接与NK细胞、T细胞、树突状细胞、单核细胞及巨嗜细胞等免疫细胞表面的杀伤细胞抑制性受体(killer inhibitory receptor, KIR)及ILT(immunoglobulin-like transcripts/CD85)结合,激活其胞内段的免疫受体酪氨酸抑制基序(Immunology receptor tyrosine-based inhibitory motif, ITIM),启动抑制性信号传导通路,从而抑制免疫细胞的功能,诱导免疫耐受。在妊娠早期,胎盘所有类型的滋养层细胞都分泌sHLA-G,母体血中sHLA-G含量与妊娠是否成功相关:若母体血中sHLA-G含量高,则妊娠易成功;否则,妊娠不易成功。在某些肿瘤、感染、器官移植、自身免疫性疾病病人的血清及组织中检测到sHLA-G。不表达膜型HLA-G1的HLA-G*0105N纯合型健康个体能正常妊娠,这些现象提示sHLA-G同样有着重要的功能。近年来对sHLA-G生物学功能研究成为HLA-G研究的新热点。Contini P等研究证实sHLA-G能抑制NK细胞,CD4+、CD8+ T细胞的功能,但其具体机制没有阐明。Fournel等研究表明,纯化的HLA-G5可在0.25μg/ml的低浓度下与CD8分子结合,刺激CD8+细胞表达CD95配体,通过Fas/FasL的途径诱导CD8+细胞凋亡。而有些研究者在用分泌HLA-G5的细胞与T细胞一起孵育时并没有观察到T细胞的凋亡增加。最近有研究表明HLA-G5可以抑制同种反应T细胞的细胞周期但不促进其凋亡。Le Rond等在体外用HLA-G5致敏初始T细胞18个小时,发现这些处理过的初始T细胞丧失了对其后同种抗原刺激的反应能力,并能抑制其他T细胞的反应性。在混合淋巴细胞培养中,CD4+、CD8+ T细胞均能表达可溶性或膜型HLA-G,作为一种负反馈信号调节CD4+同种反应性T细胞的增殖。为阐明sHLA-G的生物学作用及其作用机制,有必要获取大量有功能的sHLA-G分子,真核表达系统表达的可溶性蛋白虽然保持了蛋白原有的构象,但不能大量表达,且纯化困难。而原核表达系统表达的包涵体蛋白不能保持蛋白原有的构象,也不能进行糖基化,因此需在体外进行折叠复性和功能鉴定。本课题研究的目的是采用原核表达系统,制备大量有功能的sHLA-G1-肽复合物,并且利用同种异体T细胞混合培养的方法,观察体外折叠的sHLA-G1-肽复合物对T细胞增殖反应的影响,为进一步阐明其作用机制及临床应用奠定物质基础。我们采用HLA-G限制性的九肽KGPPAALTL与sHLA-G1重链及轻链在体外经稀释复性制备sHLA-G1-肽复合物,并建立同种异体混合淋巴细胞培养体系,验证其生物学功能。本课题的研究内容和结果如下:1、sHLA-G1重链、β2m的高效表达和纯化sHLA-G1分子的两个亚基sHLA-G1重链和β2m(轻链)均以包涵体的形式在细菌内高效表达,经IPTG诱导表达目的蛋白,提取包涵体并初步纯化后溶于8mol/L尿素中。sHLA-G1重链和β2m的蛋白产量分别为180mg/L菌液和150mg/L菌液,灰度扫描纯度分别为75.7%及65.8%,能够满足本研究制备sHLA-G1-抗原肽复合物的需要。2、sHLA-G1-抗原肽复合物分子的稀释折叠复性在分子结构上,HLA-G1与经典的HLA I类分子一样,均为包括重链、轻链和抗原肽的三分子复合物。在HLA-G1限制性的抗原肽存在的情况下,通过稀释制备得到的β2m与sHLA-G1中的变性剂而实现体外复性折叠。来自于胎盘滋养层的九肽KGPPAALTL是从HLA-G上洗脱的三种内源性自身肽的一种,它的存在可帮助共折叠形成稳定的sHLA-G1-抗原肽复合物分子。用已知仅与天然构象的HLA I类分子结合的单克隆抗体W6/32进行Western-blot鉴定,结果显示W6/32同样能够结合于折叠复合物中的成份,进一步应用W6/32与抗β2m抗体进行双抗夹心ELISA,证实体外折叠sHLA-G1-抗原肽复合物具有HLA I类分子的天然构象,说明通过原核表达、体外折叠能够成功地制备sHLA-G1单体。3、sHLA-G1对混合淋巴细胞培养中T细胞增殖的影响外周血淋巴细胞用羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester,CFSE)标记后,用同种异体的EB病毒转化的B淋巴母样细胞(EBV-LCL)刺激,此为本实验的混合淋巴细胞培养体系,代表针对同种异体抗原的T细胞应答。在96孔培养板中加入2×105荧光素标记的反应细胞和2×104刺激细胞,37℃,5%CO2培养箱中培养。在培养的第一天和第四天加入300μg/ml sHLA-G1-肽复合物及相同浓度的sHLA-A2-肽复合物、β2m作为对照,在第七天再次加入刺激细胞和蛋白,继续培养三天后流式检测T细胞的增殖情况,结果发现:三个个体中,sHLA-G1-肽复合物实验组的增殖指数均明显低于培养基对照组(个体一:5.5266±0.6124 vs 7.7350±0.4879;个体二:6.0566±0.4660 vs 8.9700±0.2353;个体三:5.8133±0.3470 vs 7.4600±0.5726; P<0.05),而HLA-G的单克隆抗体G11E5+sHLA-G1组与培养基组比较没有明显差异(个体一:7.7050±0.0777 vs 7.7350±0.4879;个体二:9.5700±0.5091 vs 8.9700±0.2353;个体三:7.200±0.6763 vs 7.4600±0.5726; P>0.05)。而sHLA-A2对照组在个体一、个体二中增殖指数都明显低于培养基对照组(个体一:5.5633±0.3523 vs 7.7350±0.4879;个体二:7.0100±0.3111 vs 8.9700±0.2353;P<0.05),而在个体三中却高于培养基对照组(9.0933±0.3859 vs 7.4600±0.5726; P<0.05)。这些结果显示原核表达、体外折叠的sHLA-G1能够抑制T细胞针对同种抗原的增殖反应。并且这种抑制作用能被针对HLA-Gα1区的单克隆抗体G11E5封闭。可溶性HLA-G是近年来HLA-G研究的一个新的热点,在体内可能发挥比膜型HLA-G更为重要的作用。本研究利用原核表达体系,在体外大量制备正确构像的sHLA-G1-肽复合物,并首次采用CFSE标记反应细胞,利用流式细胞仪准确快速的检测sHLA-G1-肽复合物对混合淋巴细胞反应中T细胞增殖的影响。成功制备出有功能的sHLA-G1-肽复合物,为进一步阐明其作用机制及临床应用奠定物质基础。