论文部分内容阅读
研究背景肺癌是我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,肺腺癌作为其中最常见的病理学亚型,其五年生存率随患者的肿瘤分期进展显著降低,故对肺腺癌（Lung adenocarcinoma,LUAD）患者进行早诊早治是降低肺癌死亡率的关键。低剂量计算机断层扫描技术（Low-dose computed tomography,LDCT）在肺癌筛查中的广泛应用可以降低肺癌的死亡率,但是筛查发现的大量肺部结节患者的良恶性鉴别及临床管理成为了新的难题。血浆蛋白因其能反映病灶情况,且具备创伤小、易检测和稳定等优点,是肺部结节良恶性鉴别诊断标志物的良好选择。研究目的通过非标记定量蛋白质组学技术及酶联免疫吸附实验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）筛选并鉴定可用于LUAD和良性肺部结节（Benign pulmonary nodules,BPN）鉴别诊断的新型血浆蛋白标志物。将有鉴别诊断潜力的新型血浆蛋白与CT指标和临床传统肿瘤标志物联合以构建LUAD和BPN的鉴别诊断模型,为临床较好地管理肺部结节患者提供帮助。此外,探索血浆差异蛋白（载脂蛋白C3,即APOC3）在肺腺癌发生发展中的功能,为肺腺癌患者寻找有效的治疗靶标提供研究基础。研究方法1.非标记定量蛋白质组学技术筛选血浆差异蛋白:选取性别年龄相匹配且已有明确病理诊断的LUAD和BPN患者各10例,对其血浆样本进行蛋白质组学分析,以差异倍数（Fold change,FC）＞1.2或＜1/1.2且P＜0.05的标准筛选差异蛋白。2.双抗体夹心法ELISA验证血浆差异蛋白:首先,利用ELISA在验证组一（包含39例LUAD和39例BPN患者血浆样本）中对差异蛋白的含量进行检测。选取在LUAD和BPN之间具有潜在鉴别诊断能力（AUC＞0.5且P＜0.05）的候选蛋白,进而在验证组二（含有107例LUAD、107例BPN、58例肺鳞癌、48例小细胞癌和44例正常对照血浆）中检测候选血浆蛋白的表达情况。3.候选蛋白联合CT指标和临床传统肿瘤标志物构建鉴别诊断模型:利用单因素分析和受试者工作特征（Receiver operating characteristic,ROC）曲线分析,从12种CT指标和3种传统肿瘤标志物中筛选可用于鉴别LUAD和BPN患者的指标。使用Logistic回归分析法（输入法）将候选蛋白和有意义的CT指标及传统肿瘤标志物联合,构建LUAD和BPN的鉴别诊断模型,评估该模型在不同临床特征肺腺癌患者中的诊断效能。4.肺腺癌组织中APOC3表达量验证:通过提取CELL杂志中一篇关于肺腺癌组织蛋白质组学研究的文献数据,分析候选蛋白在103例LUAD患者组织中表达情况,选出在癌组织和癌旁组织中表达量具有显著差异的蛋白指标,即APOC3。利用组织芯片进行免疫组化实验,在88例LUAD患者配对的癌组织和癌旁组织中检测APOC3的表达情况,并结合患者临床信息和随访资料进行统计分析及生存分析。5.肺腺癌细胞中APOC3功能探索:构建过表达APOC3的稳转细胞株,通过CCK8增殖实验探索APOC3对肺腺癌细胞增殖能力的影响,通过Transwell-迁移实验探索APOC3对肺腺癌细胞迁移能力的影响,通过油红O染色实验探索APOC3对肺腺癌细胞内甘油三脂含量的影响。6.血浆APOC3与血脂相关性分析:收集验证组一及验证组二中LUAD、BPN患者和正常对照的临床血脂数据,使用Mann-Whitney U test非参检验分析LUAD患者和BPN患者之间以及LUAD患者与正常对照之间的血脂水平差异。通过Pearson相关性检验分析LUAD患者血浆内APOC3水平与血脂指标的相关性。7.统计学分析方法:利用Image J和Image Pro plus 6.0软件对细胞实验结果进行量化处理。利用SPSS 26.0,Graph Pad Prism 8.0和R 4.0软件对实验数据进行统计学分析及结果的可视化。使用非参检验（Mann-Whitney U检验）的方法分析各指标或模型在不同组间的差异。使用ROC曲线获得各指标或模型在LUAD和BPN鉴别诊断时的ROC曲线下面积（AUC）、灵敏度、特异度（截断值为最大约登指数时所对应的指标浓度或模型预测概率）。使用Kaplan-Meier生存曲线分析免疫组化结果中APOC3蛋白表达水平对LUAD患者生存时间的影响。所有统计学分析均认定P＜0.05时为差异有统计学意义。研究结果1.通过非标记定量血浆蛋白质组学分析,筛选出12种在LUAD和BPN患者中表达具有显著差异的蛋白指标,包括8种上调蛋白（ENPP2、FCGR3B、HGFAC、CLEC3B、SERPINA7、ICAM、LYZ、LUM）和4种下调蛋白（PON1、PRDX2、CA2、APOC3）,其中ENPP2的上调倍数最高（FC=1.49）,APOC3的下调倍数最高（FC=0.36）。2.利用双抗体夹心法ELISA,对12种差异蛋白中通过ELISA预实验检测的9种差异蛋白,在验证组一的血浆样本中检测其表达量,筛选出具有LUAD和BPN鉴别诊断能力且与血浆蛋白质组学结果一致的三种蛋白指标（PRDX2、PON1、APOC3）作为候选蛋白。在验证组二中进一步验证三种候选蛋白用于LUAD和BPN鉴别诊断的能力,结果显示,三者的AUC（95%CI）分别为0.603（0.527-0.678）、0.772（0.710-0.835）和0.706（0.638-0.775）。此外,APOC3在LUAD患者血浆中表达量显著低于正常对照人群（P＜0.05）。3.经单因素分析和ROC分析,从12种CT指标和3种临床传统肿瘤标志物中筛选出3种有诊断潜力的CT指标（毛刺征、血管切迹征、分叶征）和3种传统标志物（CEA、CA125、CYFRA21-1）。利用Logistic回归分析的方法将3种候选蛋白、3种CT指标和3种传统标志物联合构建鉴别诊断模型:PRE（P=LUAD,model）=1/（1+EXP（﹣（0.010×PRDX2+0.052×APOC3+0.002×PON1+1.112×毛刺征+1.161×血管切迹征+0.535×分叶征﹣0.084×CEA﹣0.004×CA125﹣0.404×CYFRA21-1﹣7.697）））。该模型在区分LUAD和BPN时,AUC（95%CI）达0.904（0.859-0.949）,灵敏度为81.44%,特异度为90.14%。4.基于血浆蛋白质组筛选和ELISA鉴定获得的三个候选蛋白,利用文献提取数据分析后发现,三种候选蛋白中仅APOC3在LUAD癌组织中蛋白表达量显著低于癌旁组织（P＜0.001）,但APOC3在肺癌发生发展中的功能研究尚未见报道,故对APOC3进行进一步的功能探讨。肺腺癌组织芯片的免疫组化检测结果显示,与癌旁组织相比,APOC3在肺腺癌组织中表达量显著下调（P＜0.001）,且低表达APOC3的肺腺癌患者有较短生存期的趋势。5.细胞实验显示,过表达APOC3可显著抑制肺腺癌细胞的增殖和迁移（P＜0.01）,对肺腺癌的进展有显著抑制作用;过表达APOC3的肺腺癌细胞中甘油三酯的含量显著增高（P＜0.05）;临床数据分析显示LUAD患者血浆内甘油三脂含量低于正常人群（P＜0.05）,且LUAD患者血浆内甘油三酯含量与APOC3水平成明显正相关（r=0.182,P＜0.05）。研究结论1.PRDX2、PON1和APOC3均在肺腺癌患者血浆中下调,可作为肺腺癌和良性肺部结节患者鉴别诊断的新型血浆蛋白标志物。2.包含PRDX2、PON1、APOC3、结节毛刺征、结节血管切迹征、结节分叶征、CEA、CA125和CYFRA21-1九种变量的鉴别诊断模型对肺腺癌和良性肺部结节患者具有良好的鉴别诊断效能。3.APOC3在肺腺癌组织内低表达;过表达APOC3可显著抑制肺腺癌细胞的增殖和迁移,并影响甘油三酯的产生和代谢。