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结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，手术切除根治后患者出现复发和转移的几率为50-60%，结直肠癌患者术后肿瘤复发、浸润和远处转移等恶性生物学行为，是其主要的死亡原因。大肠癌最常见的远处转移脏器是肝脏。肿瘤干细胞的存在是肿瘤复发、浸润和远处转移的主要原因，因为肿瘤干细胞对肿瘤治疗的化学药物不敏感，所以传统的放疗化疗只能杀死终末分化的普通肿瘤细胞，而对肿瘤干细胞作用效果并不明显。在治疗后残存的肿瘤干细胞又通过不断扩增而引起肿瘤的复发及转移。大量的研究表明，多糖在治疗肿瘤和预防肿瘤复发等方面有着特有的优势和特点。多糖有免疫调节活性及抗肿瘤作用，与其他治疗肿瘤的化学药物相比，中药多糖对肿瘤的治疗具有低毒、有效、价廉、不对机体造成损伤等优点，具有广阔的临床应用前景和深远社会意义。本课题获得了国家科技重大专项“重大新药创制”项目的资助，主要进行：将肿瘤干细胞的研究与我国传统中草药多糖防治肿瘤研究结合在一起，研究多糖是否可以肿瘤干细胞为靶点，控制肿瘤干细胞的增殖等生物学行为，进而探究其治疗肿瘤，预防肿瘤复发转移的生物学效应，本研究将对开发新的抗肿瘤药物具有重要意义和应用价值。因为五味子多糖和桔梗多糖在体内有增强机体免疫、抑制肿瘤增殖等作用，所用本研究在对结直肠癌干细胞生物学行为研究的基础上，又进行了以五味子多糖和桔梗多糖，对人结直肠癌HT-29细胞系和结直肠癌肿瘤干细胞的生物学行为干预作用的研究，并对两种多糖抗肿瘤的作用机制进行了初步探讨，为该药特异性靶向调控肿瘤干细胞提供实验基础和理论依据。1.人结直肠癌肿瘤干细胞的分离及生物学研究方法：取120例结直肠癌行根治性手术患者肿瘤样本，40例有早期肝转移，80例无肝转移。流式细胞仪分析CD133~+/CD44~+亚群细胞含量，并据此进行CD133~+/CD44~+亚群的分选培养，用NOD/SCTD鼠检验CD133~+/CD44~+亚群的体内成瘤能力，并用Western blot验证CD133和CD44的表达，检验其生物学特点，确定结直肠癌肝转移的分子标记物。结果：80例无早期肝转移的病例，CD133~+/CD44~+的共表达12例（15%），而40例由早期肝转移的病例中有36例出现CD133~+/CD44~+共表达现象（90%）其检测大肠癌肝转移的敏感性和特异性分别是75%和94.44%。通过肝转移相关因素的多元统计分析(P<0.05)。CD133~+/CD44~+表型的细胞亚群比non-CD133~+/CD44~+表型的细胞亚群,在CFCP培养体系中更易增殖，形成集落。1×103个CD133~+/CD44~+结肠癌干细胞能形成移植瘤，随着细胞数目的增多，成瘤率逐渐增高。肿瘤生长2w、4w、6w后检测CD133和CD44蛋白含量逐渐下降。结论：人结直肠癌细胞中含有CD133~+/CD44~+表型的亚群，与non-CD133~+/CD44~+细胞亚群比，具有更高的增殖能力和体内成瘤能力，说明CD133~+/CD44~+亚群即为结直肠癌的肿瘤干细胞。且样本分选结果证明，肿瘤细胞CD133~+/CD44~+的表达，可以作为临床诊断结直肠癌早期肝转移的临床诊断标记物。2. ASPS、PRPS对人结肠癌细胞株HT-29的干预作用研究方法：MTT法检测ASPS、PRPS对人结肠癌细胞株HT-29增殖能力影响。用血清药理学的方法制备ASPS、PRPS的含药血清，再用MTT法检测含药血清对HT-29细胞增殖能力影响，流式细胞仪检测含药血清对HT-29细胞的凋亡作用。Transwell侵袭小室模型，观察含药血清对HT-29细胞侵袭能力的影响。研究了ASPS、PRPS对凋亡通路中信号物质bcl-2, bαx和Caspase-3的表达的干预作用。结果：ASPS和PRPS在体外对人结肠癌细胞HT-29没有明显杀伤作用。高、中剂量组ASPS和PRPS含药血清对HT-29细胞的增殖有抑制作用，可以诱导HT-29细胞的凋亡，ASPS有抑制HT-29体外侵袭基底膜成分Matrigel的能力。ASPS、PRPS可以使bαx基因的表达上调，bcl-2表达下调，上调Caspase-3的表达，激活凋亡信号通路。结论：ASPS和PRPS含药血清可以在体外抑制HT-29细胞的增殖，和侵袭能力，并诱导其凋亡。可以作用于bcl-2家族，活化Caspase-3，诱导凋亡。3. ASPS、PRPS对结直肠癌肿瘤干细胞的调控作用方法：用MTT法研究ASPS、PRPS含药血清对CD133~+/CD44~+亚群细胞增殖能力和集落形成的干预作用，研究了ASPS对CD133~+/CD44~+亚群细胞中Wnt信号通路中β-catenin表达的干预作用。结果：ASPS含药血清对CD133~+/CD44~+细胞集落形成有很明显的抑制作用。中浓度ASPS血清对CD133~+/CD44~+细胞的生长在24小时的时间点有抑制作用(P<0.05)，高浓度ASPS血清在24、48、72小时各时间点上均有抑制作用(P<0.05)。PRPS血清无作用。ASPS含药血清干预后的人结肠癌CD133~+/CD44~+细胞中总的β-catenin呈现低表达。结论：ASPS含药血清可以在体外抑制结直肠癌干细胞的增殖，并且能够下调与肿瘤干细胞生物学相关的Wnt信号通路的活性。