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[背景]保守、通用的遗传密码决定了所有有机体中所有蛋白质的氨基酸序列。然而，这个密码不足以提供能明确这些蛋白质三维结构和功能的相关信息。研究表明由互补的核酸序列编码的有义肽和反义肽之间存在特殊的相互作用，由此就提出了有第二套二维的遗传密码即蛋白密码的存在。M-I（Mekler-Idlis）配对理论，提出了有义肽中密码子编码的氨基酸残基可与相应的互补肽中密码子编码的残基发生特定的两两相互作用。AHBs（反义同源盒）理论和分子识别理论描述了蛋白分子内和蛋白分子间可以特异结合的区域结构具有正义与反义的关系。受体与配体的相互作用实质上是蛋白质分子间的识别、结合和相互作用的过程。将受体看作是有义肽，那么可与之特异结合的配体分子中可能存在一段或多段反义肽，而且其存在的部位是配体功能的关键位置。Fas（APO-1，CD95）属于肿瘤坏死因子超家族之一员，是Fas配体（FasL）的受体。当它的配体FasL与之结合后，可以引起表达Fas的细胞发生凋亡。本研究依据AHBs理论，应用自行编写的软件，在FasL分子中寻找到与Fas相应的反义多肽最为接近的十肽结构即FasL256-265（匹配度为70％）。化学合成了十肽结构，与重组FasL-ECD（FasL胞外区）平行对照，研究了其对培养的肿瘤细胞的相互作用。本研究为依据ABHs理论，筛选与开发具有诱导细胞凋亡的抗肿瘤多肽类药物具有一定的指导意义。[目的] （1） 分析人黑色素瘤细胞（A375）中FasL基因的表达，克隆人FasL胞外区的编码基因，并在大肠杆菌BL21中进行表达。纯化重组蛋白FasL-ECD，并分析其生物学活性，筛选出对之最敏感的肿瘤细胞株；（2） 根据生物信息学软件分析结果，选取FasL胞外区256-265的十肽（N）-HLYVNVSELS-（C） 作为目标分子，委托生物公司合成该十肽；（3）分析FasL-ECD和十肽对最敏感肿瘤细胞的毒性作用，分析重组FasL一ECD及十肤作用的相关性。l方法】采用新鲜人黑色素瘤细胞（A375），抽提该细胞的总RNA，进行RT一PCR反应分析A375内FasL全长编码基因的转录表达，以A375细胞cDNA为模板，用PCR产物直接克隆法扩增人FasL一ECD（人FasL胞外区）的编码基因，即1 27一278位氨基酸残基，而后将PCR产物直接克隆于pMD一1 ST载体中，获得重组质粒pMD一T-FasL一ECD，进行DNA测序。将测序证实的FasL胞外区基因亚克隆到商品化的原林表达载体PET一lla中。用PCR和酶切鉴定的方法筛选出阳性重组子，将阳性重组子以Ilnlnol几IPTG进行诱导表达，以SDS一PAGE分析FasL胞外区的表达。对表达的蛋白作初步纯化处理。 培养肿瘤细胞，如人1990（人胰腺癌），HepG一2（人肝细胞癌），M85（人胃癌），HL60（人早幼粒细胞白血病），NC卜H460（人大细胞肺癌），以及K562（白血病）等近三十株肿瘤细胞。细胞生长在含10%小牛血清和1%青、链霉素的砂Ml 1 640培养液中，培养箱内含50，0 CoZ，温度37oC。 将肿瘤细胞种于96孔板，培养8一10h后，加入初步纯化处理后的FasL一ECD，BL21和BL21一PET一11a对照，初步筛选出最敏感的细胞。 利用生物信息学软件选取FasL胞外区256一265的十肤(N》HLYVNVSELS一（C），委托生物公司（申友生物公司、上海生工生物公司）合成该十肤。 将肿瘤细胞种于96孔板，每孔约2xl了个，培养18一24h后，加入初步纯化处理后的FasL一ECD和合成的十肤，设BLZI和BLZI一PETlla对照，通过形态学观察和酶标仪检测和分析重组sFasL及十肤诱导细胞凋亡的作用及两者间的相关性。I结果l人黑色素瘤细胞可表达人FasL基因，以A375细胞cDNA为模板扩增FasL一ECD，扩增出清渐DNA条带，大小为468 bp，与实验设计相一致。FasL一ECD的PCR扩增产物直接克隆到pMD一1 ST载体中，获得重组质粒pMD一T一FasL一EcD，经DNA序列测定证实与Genbank的人FasL基因序列一致。将胞外区片段克隆入表达载体，成功地转化入大肠杆菌BLZI中并得到表达，SDS一PAGE电泳显示其分子量约为20kDa，表达产物具有诱导多种肿瘤细胞凋亡的活性。所合成的十肤也具有诱导肿瘤细胞凋亡的活性。对两者皆较敏感的是NCI一H460（大细胞肺癌），HepGZ（肝细胞癌）。合成的十肤可以与Fas结合，发生有义一反义多肤之间特殊的相互作用。l结论1本研究对人FasL胞外区编码基因进行克隆，在大肠杆菌中表达，为进一步开展FasL的功能研究打下了基础。在BL21中重组表达的sFasL和合成的十肤皆具有生物学功能，可抑制NCI一H460，HepGZ细胞的生长并引起细胞凋亡。 合成的十肚可以诱导表达Fas的肿瘤细胞发生凋亡，提示该十肤与Fas上相应的十肤结合，发生有义一反义多肚之间特殊的相互作用，而且该十肤是FasL功能的关键位置，即所谓的功能域。