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细菌在环境工程、生物医药等诸多领域发挥着重要作用,然而细菌在极端环境下面临着生存困境。在自然界中,生物体具有合成形态精细和结构复杂的生物矿物质的能力,如骨、牙齿的形成。大部分细菌本身不具有生物矿化的能力,研究人员提出通过仿生矿化的方法对细菌进行改造和修饰,从而提高细菌对不良环境的耐受能力,在各领域发挥积极作用。类沸石咪唑酯骨架材料-8(zeolitic imidazolate framework-8,ZIF-8)是由过渡金属离子Zn2+和2-甲基咪唑作为桥联单元的金属有机框架化合物,具有稳定的沸石拓扑学结构,生物相容性好,可以作为细菌的仿生矿化外壳,帮助细菌抵抗不良环境。微流控技术是指对微纳尺度的流体的精准控制,是实现高效的仿生矿化的潜在方法。大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)是常用于各种研究的模式菌。大肠杆菌Nissle 1917(Escherichia coli Nissle 1917,Ec N)作为益生菌被使用已具有100多年的历史,被广泛应用于胃肠道疾病的治疗。研究表明Ec N可以靶向肿瘤组织、调节宿主免疫反应等。Ec N在口腔肿瘤方面的相关研究较少,而口腔肿瘤的复杂环境可能影响Ec N的存活和发挥作用。目的:本实验旨在研发基于微流控技术的细菌表面仿生矿化,探究仿生矿化的大肠杆菌(E.coli@ZIF-8)对营养缺乏、紫外线等极端环境的耐受能力,初步研究仿生矿化大肠杆菌Nissle 1917(Ec N@ZIF-8)对人舌鳞癌Cal-27细胞的作用。方法:(1)基于微流控技术利用2-甲基咪唑和二水醋酸锌分别对E.coli、表达绿色荧光蛋白(GFP)的基因工程大肠杆菌和益生菌Ec N进行仿生矿化。(2)利用X射线光单子能谱(XPS)、X射线衍射(XRD)、透射电镜(TEM)、扫描电镜(SEM)、傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR)等对E.coli@ZIF-8的结构、形貌等进行表征。对表达GFP的基因工程大肠杆菌进行仿生矿化,应用激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)、流式细胞仪进行共定位分析。(3)将E.coli@ZIF-8置于营养缺乏的环境下7天,然后测定细菌的生长曲线。将E.coli@ZIF-8进行紫外线的照射,应用FDA/PI双染法检测活/死细胞,利用DCFH-DA荧光探针标记细胞内活性氧(ROS),检测经紫外线照射后ROS产生的变化。(4)采取CCK-8法检测仿生矿化外壳ZIF-8对Cal-27细胞生长的影响。对Ec N进行仿生矿化,利用CCK-8法检测Ec N、Ec N@ZIF-8对Cal-27细胞的作用。结果:(1)本实验采用了以微量注射泵为动力、辅以超声的微流控装置,分别完成了对E.coli、表达GFP的基因工程大肠杆菌和Ec N的仿生矿化。(2)XPS、XRD和EDS的结果显示E.coli@ZIF-8与ZIF-8的特征峰一致,锌元素含量为16.9%;SEM、TEM、Mapping的结果显示仿生矿化的E.coli表面形成了一层均匀、一致的外壳,而且锌元素在E.coli@ZIF-8表面分布均匀;FT-IR的结果说明E.coli和ZIF-8之间通过氢键交联;CLSM的结果证实E.coli和ZIF-8共定位良好,流式细胞仪的结果显示细菌的包封率高达86.7%。(3)E.coli@ZIF-8耐受缺乏营养的极端环境,去除外壳后可以恢复生长活性。E.coli@ZIF-8具有耐受紫外线照射的能力,且仿生矿化的细菌经紫外线照射后产生的ROS减少。(4)ZIF-8对Cal-27细胞生长的影响较小。Ec N和Ec N@ZIF-8对Cal-27细胞均有一定的抑制作用。在相同细菌浓度下,Ec N@ZIF-8表现出更好的抑制Cal-27细胞的作用。结论:本实验完成了基于微流控技术的细菌表面的仿生矿化,提高了细菌对营养缺乏、紫外线等极端环境的耐受能力。仿生矿化可以提高Ec N对人舌鳞癌Cal-27细胞的抑制作用,仿生矿化的益生菌在口腔肿瘤治疗方面具有潜在的应用价值。