【摘 要】
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目的:利用PCV2诱导小鼠肺炎模型,探讨苦参碱在小鼠体内的抗炎作用及机制。方法:选取4周龄32只雌性SPF级别昆明小鼠,体重20±2 g,按体重随机均分成4组,每组8只,即:空白对照组、PCV2组、苦参碱组（40 mg/kg）、阳性对照组（利巴韦林40 mg/kg）。除空白对照组外,其他各组小鼠通过每只腹腔注射0.5 m L 105.4TCID50/m L的PCV2攻毒,同时对空白对照组小鼠等体积
【基金项目】
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国家重点研发计划（2017YFD0501500）； 国家自然科学基金（31702285）； 山西省优秀青年科学基金（201801D211003）；
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目的:利用PCV2诱导小鼠肺炎模型,探讨苦参碱在小鼠体内的抗炎作用及机制。方法:选取4周龄32只雌性SPF级别昆明小鼠,体重20±2 g,按体重随机均分成4组,每组8只,即:空白对照组、PCV2组、苦参碱组（40 mg/kg）、阳性对照组（利巴韦林40 mg/kg）。除空白对照组外,其他各组小鼠通过每只腹腔注射0.5 m L 105.4TCID50/m L的PCV2攻毒,同时对空白对照组小鼠等体积腹腔注射生理盐水,于接种PCV2后的第5 d开始腹腔注射对应药物,每天定点给药一次,连续用药5 d,空白对照组小鼠腹腔注射和药物等剂量的生理盐水。在PCV2接种后的第11 d（即给药结束后1d,用药6 d）,剖检小鼠,采集肺脏样本,制备肺组织病理切片,采用苏木精-伊红（HE）染色镜检观察小鼠肺脏的病理组织学变化并进行肺损伤评分,确定肺炎模型是否建立成功。提取肺组织RNA和总蛋白,采用实时荧光定量法（q PCR）和蛋白免疫印迹法（Western blot）检测各组肺组织中促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α）的m RNA和蛋白表达水平的影响,确定苦参碱能否抑制PCV2引起的炎症反应。Western blot检测各组肺组织总蛋白中对调控IL-1β产生过程相关关键的蛋白:Toll样受体4（TLR4）、髓样分化因子88（My D88）、核因子κB p65（NF-κBp65）、磷酸化核因子κB抑制蛋白α（p-IκBα）、核因子κB抑制蛋白α（IκBα）、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶1（Caspase-1）、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、NOD受体3（NLRP3）蛋白的表达水平的影响,确定苦参碱抗PCV2诱导炎症反应的机制。结果:1.利用HE染色,光镜下观察苦参碱对PCV2感染的小鼠肺脏病理变化的影响并对其进行肺损伤评分。结果显示:与空白对照组小鼠相比,PCV2组小鼠的肺组织的肺间质显著增宽,肺泡腔显著缩小。同时观察到中等量的炎性细胞、红细胞浸润,肺损伤评分显著上升（p＜0.001）。与PCV2组相比,苦参碱组小鼠肺间质增宽现象有所缓解,肺损伤评分显著下降（p＜0.001）。说明PCV2感染小鼠后可引起间质性肺炎,肺炎模型成功建立,而加入苦参碱干预后能改善其症状。2.利用q PCR法和Western blot法检测PCV2感染小鼠11 d（用药6 d）后,各组小鼠肺组织中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8的m RNA和蛋白的表达水平。结果显示:与空白对照组相比,PCV2感染小鼠11 d（用药6 d）炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的m RNA和蛋白的相对表达量均显著上升（p＜0.001）。与PCV2组相比,苦参碱组和阳性对照组IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的m RNA和蛋白的表达水平均显著下降（p＜0.001）。结果进一步表明炎症模型成功建立,苦参碱能抑制PCV2诱导的小鼠肺炎。3.Western blot法检测各组小鼠肺组织中TLR4和My D88的蛋白表达水平,结果显示:与空白对照组相比,PCV2组小鼠肺组织中TLR4和My D88的蛋白表达水平均显著升高（p＜0.001）。与PCV2组相比,苦参碱组和阳性对照组小鼠肺组织中TLR4和My D88的蛋白表达水平均显著下降（p＜0.001）。结果表明苦参碱可抑制TLR4/My D88信号通路的活化。4.Western blot法检测各组小鼠肺组织中NF-κB信号通路的活化情况,结果显示:与空白对照组相比,PCV2组小鼠肺组织中p-IκBα和NF-κBp65蛋白表达水平均显著上升,IκBα蛋白的表达水平降低（p＜0.001）。与PCV2组相比,苦参碱组和阳性对照组小鼠肺组织中p-IκBα和NF-κBp65蛋白的表达水平均显著下降（p＜0.001）,且IκBα蛋白表达水平显著上升（p＜0.001）。结果表明苦参碱可抑制NF-κB信号通路的活化。5.Western blot法检测各组小鼠肺组织中NLRP3炎症小体的活化情况,结果显示:与空白对照组相比,PCV2组小鼠肺组织中NLRP3、ASC和Caspase-1的蛋白表达水平均显著上升（p＜0.001）。表明PCV2的感染诱导激活了NLRP3炎症小体。与PCV2组相比,苦参碱组和阳性对照组中NLRP3、ASC和Caspase-1的蛋白表达水平均显著下降（p＜0.001）。结果表明苦参碱可抑制NLRP3炎症小体的激活。结论:1.苦参碱可改善PCV2感染诱导的小鼠肺间质增宽,并明显降低小鼠肺组织中炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α表达水平,证实了苦参碱可以抑制PCV2感染诱导的小鼠肺炎。2.苦参碱可通过抑制TLR4/My D88/NF-κB信号通路的活化以及NLRP3炎症小体的激活,来发挥抗PCV2诱导的小鼠肺炎作用。
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