研究背景酸碱平衡是维持细胞内环境稳定,保证细胞正常代谢与功能的前提,而受诸多因素的影响,机体pH会发生一定的波动。pH改变会引发细胞内一系列信号变化,参与多种病理生理过程的调控。例如严重烧创伤、严重感染、慢性肾衰及代谢性疾病等发生后,细胞产酸大于排酸,导致酸中毒,造成细胞损伤、组织脏器功能障碍。而胞浆碱化与细胞增殖密切相关,是恶性肿瘤重要特征之一。这提示我们pH对细胞功能状态具有重要调控作用。心脏是循环系统的动力器官,严重烧伤后早期即出现心脏损伤。心脏受损不仅可引起心功能不全,还可进一步加重全身其它组织器官缺血缺氧性损害。因此,烧伤后心肌损害的研究具有极其重要的理论与临床意义。既往研究表明pH下降在介导心脏损伤中发挥重要作用,酸中毒可导致心肌兴奋-收缩耦联障碍,造成心肌收缩力减弱,还可直接损害心肌细胞超微结构造成器质性损害。但pH如何引起心肌损伤,其发生规律及具体分子机制仍不完全清楚。自噬是指溶酶体介导的胞浆物质被降解循环再利用的过程,可更新细胞内衰老、变性或错误折叠的蛋白,清除多余或受损的细胞器,以维持细胞内环境稳态。既往研究证明,自噬在心肌组织中广泛存在,涉及到许多心脏疾病的心肌病理学过程,对于稳定心脏结构和功能有着重要的作用。例如在缺血性心肌病、心力衰竭、心肌炎及心肌肥厚等疾病过程中,心肌细胞的自噬活动会增强。但自噬是否参与调控了pH异常引起心肌损伤及发挥何种作用目前尚不清楚。有研究表明,细胞外pH的改变会影响MCF-10A、MCF-7、Hela等细胞的自噬活性,Marino等的研究发现酸性环境能激活人黑色素瘤细胞的自噬,从而促进细胞存活,这提示我们pH是影响细胞自噬重要因素,且具有细胞特异性。因此我们推测:pH是否通过调控自噬引起心肌细胞功能改变。细胞自噬的诱导和调控是一个非常复杂而精密的过程,许多因素均可以诱导细胞产生自噬,如缺氧、营养压力、氧化应激压力均可激活细胞自噬,同时又有许多信号分子参与自噬的调控,如能量信号主要通过AMPK调控自噬,丝裂原信号主要通过mTORC1影响自噬活性,其他的还有p53、beclin1等信号通路均可参与自噬的调控。一磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)是一种进化保守的、功能强大的丝/苏氨酸蛋白激酶,在心脏中,多种损伤如饥饿、缺血缺氧以及氧化应激等均可导致AMPK激活。活化的AMPK在维持细胞能量代谢和细胞存活中发挥重要作用。其中,自噬就是AMPK依赖的一种重要的适应和存活机制。然而关于AMPK如何调控自噬,目前存在不同的说法。较早的研究认为AMPK活化后能够通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶点(Mammalian target of rapamycin,m TOR)活性激活自噬。随着对AMPK功能及作用机制的研究深入,越来越多的研究发现AMPK可以直接作用于ULK1调控自噬,而且大量研究证明AMPK-ULK1是诱导自噬的关键。然而在酸、碱处理条件下AMPK调控心肌细胞自噬的下游信号仍不清楚。本课题旨在研究pH对心肌细胞自噬活性的影响及其相关分子机制,为pH改变所致的心肌损伤的临床防治提供新的思路。研究方法1.通过调控培养基pH模拟细胞外酸、碱化条件,采用CCK8及LDH释放检测酸、碱处理条件下心肌细胞活力的改变。采用蛋白免疫印记(Western blot,WB)和免疫荧光(Immunofluorescence,IF)检测酸、碱处理条件下心肌细胞自噬活性的变化。然后采用荧光分子探针检测酸、碱处理条件下溶酶体酸度的改变,进一步用巴佛洛霉素A1(bafilomycin A1,Baf A1)抑制溶酶体酸化后,检测酸、碱处理条件下自噬活性的变化。2.首先采用WB检测酸、碱处理条件下心肌细胞AMPK活性的变化。使用重组腺病毒转染技术构建了低表达AMPKα2的心肌细胞模型。然后干预AMPK,采用WB和IF检测酸、碱处理条件下心肌细胞自噬水平的变化。此外,采用CCK8、LDH释放及SYTOX green检测酸、碱处理条件下AMPK及其调控的自噬对心肌细胞活力的影响。3.首先采用WB检测酸、碱处理条件下心肌细胞mTORC1活性的变化。干预AMPK,采用WB检测酸、碱处理条件下心肌细胞mTORC1活性的改变。进一步干预mTORC1,检测其对酸、碱处理条件下心肌细胞AMPK活性及自噬水平的影响。采用WB检测了酸、碱处理条件下ULK1活性的改变。干预AMPK,检测酸、碱处理条件下心肌细胞ULK1活性的变化。建立了低表达ULK1的心肌细胞模型。干预ULK1,采用WB和IF检测酸、碱处理条件下心肌细胞自噬水平的变化。最后采用CCK8、LDH释放及SYTOX green染色检测酸、碱处理条件下ULK1及其调控的自噬对心肌细胞活力的影响。结果1.酸化处理3h后,即发现心肌细胞活力明显下降,且随着处理时间的延长,心肌细胞损伤加重;碱化处理后早期,细胞活力增加,持续碱化作用可导致细胞活力下降。酸化处理后,LC3-I向LC3II转换减少;碱化处理诱导LC3-I向LC3II转换增多。酸、碱化处理后,与自噬活性负相关的p62蛋白表达均下降。免疫荧光显示LC3和LAMP1共定位良好;溶酶体检测结果提示细胞外pH改变后6 h,溶酶体的酸度未见明显下降;采用BafA1处理后,酸、碱处理条件下心肌细胞LC3-II蛋白及p62蛋白均显著积累。2.酸化处理抑制心肌细胞AMPK活性,碱化处理诱导心肌细胞AMPK激活。酸化处理6 h后,细胞自噬水平下降,而使用Met激活AMPK后细胞自噬水平升高,使用AMPKα2 sh RNA抑制AMPK活性可逆转Met诱导的自噬活性上调;碱化处理后6h自噬水平升高,使用AMPKα2 sh RNA抑制AMPK活性可显著阻断碱化处理诱导的自噬水平上调。酸化处理6 h后,心肌细胞活力下降,死细胞数目增加,而使用Met激活AMPK和自噬活性后,酸化处理诱导的细胞损伤减轻,死细胞数目减少,使用AMPKα2 sh RNA抑制AMPK活性可阻断这一效应;碱化处理6 h后,细胞活力升高,死亡细胞减少,使用AMPKα2 sh RNA抑制AMPK活性后细胞活力下降,细胞死亡数目增多。3.酸化处理下调心肌细胞mTORC1活性,碱化处理诱导mTORC1激活。酸、碱处理条件下,使用Met和AMPKα2 sh RNA激活/抑制AMPK6 h后,mTORC1活性无明显变化。酸、碱处理条件下,使用m EGF/RAPA激活/抑制mTORC16 h后,AMPK活性和自噬水平均无显著变化。酸化处理抑制心肌细胞ULK1活性,碱化处理诱导ULK1激活。酸化处理6 h后,ULK1活性下降,而使用Met激活AMPK后细胞ULK1活性增强,使用AMPKα2 sh RNA抑制AMPK活性可逆转Met诱导的ULK1激活;碱化处理上调ULK1活性,使用AMPKα2 sh RNA干扰后可抑制这一效应。酸化处理6 h后,自噬水平下降,而使用Met激活AMPK和ULK1后细胞自噬水平上调,进一步使用ULK1 sh RNA抑制ULK1活性可逆转Met诱导的自噬活性增高;碱化处理诱导自噬水平升高,使用ULK1 sh RNA敲降ULK1表达可显著阻断这一过程。酸化处理6h后,细胞活力下降,死亡细胞增加,而使用Met激活AMPK和自噬活性可减轻酸化诱导的细胞损伤,进一步使用ULK1 sh RNA敲降ULK1表达可阻断这一效应;碱化处理6 h后,细胞活力升高,死亡细胞减少,使用ULK1 sh RNA敲降ULK1表达后细胞活力下降,细胞死亡数目增多。结论1.酸化处理导致细胞损活力下降,碱化处理后早期细胞活力升高,持续作用细胞活力下降。酸化处理后,心肌细胞自噬活性明显下降;碱化处理诱导自噬激活,酸、碱化处理后均不伴有自噬通量的损伤。2.pH可调控心肌细胞AMPK的活性,AMPK介导了pH对原代心肌细胞自噬活性及细胞活力的调控。3.pH可调控心肌细胞中mTORC1的活性,酸、碱处理条件下,AMPK和mTORC1的相互作用不明显,mTORC1信号通路在pH介导的心肌细胞自噬调控中不发挥主要作用。酸、碱处理条件下,ULK1可能是AMPK的重要下游靶标之一,AMPK可能通过调控ULK1信号通路介导心肌细胞自噬活性和细胞活力的改变。4.酸、碱处理条件下,早期发生的细胞自噬均有保护心肌的作用,抑制自噬活化会加重心肌细胞损伤。5.在严重烧伤抗休克治疗中,如何使血液酸碱度控制在既不影响血红蛋白释放氧,又不影响细胞生命活动的范围内,对减轻组织细胞缺血缺氧损害,提高抗休克治疗效果具有非常重要的临床指导意义。6.本课题在一定程度上阐明了pH对心肌细胞自噬的影响及其相关机制,为pH改变所致的心肌损伤的临床防治提供新的思路。