支气管哮喘是一种全球性疾病,无地域和种族的局限性,也无年龄和性别的明显差异。支气管哮喘病因复杂,是以具有间歇性、可逆性的气道阻塞、支气管高反应性和淋巴细胞、嗜酸性粒细胞浸润气道粘膜下层为特征性的慢性气道炎症。关于气道炎症的发生,以往的研究普遍认为主要是免疫源性炎症,但其具体机制尚不十分清楚还有待进一步的研究。多数学者认为辅助性T淋巴细胞两种亚型(Thl和Th2)的失衡是哮喘发生的重要机制,具体则表现为Th2细胞的活化亢进,这是哮喘发病机制中的关键环节。Th1、Th2是由共同的前体细胞,即ThO分化而来,转录因子GATA-3是特异性调控ThO分化,起着Thl/Th2转换开关作用的关键因子之一,IFN-γ和IL-4则分别是Thl和Th2类细胞因子的主要代表。近年来,气道炎症的Thl7细胞因素日益受到重视。Thl7细胞是机体中一类能产生IL-17的T细胞,RORγt是其特异性转录因子。IL-17A是近期发现的一种细胞因子,是属于一个独特类型的具有多种功能的细胞因子,可以通过诱导释放的促炎症因子和促中性粒细胞动员的细胞因子协调局部组织的炎症,在炎症性疾病和自身免疫性疾病,特别是在哮喘过敏性气道炎症中发挥重要作用。RNA干扰(RNAi)是高度保守的基因沉默技术,它在功能上与基因敲除或基因沉默一致,但比基因敲除技术更为方便快捷。在本研究中,我们利用RNA干扰技术在急性哮喘小鼠模型中探讨GATA-3对RORγt表达以及对Thl7细胞分化及其致炎机能的影响。研究的主要目的之一是探讨RORγt对急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞亚群Th17细胞分化和致炎机能的影响；研究的主要目的之二是通过RNA干扰GATA-3基因表达,观察急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞中RORγt的表达变化及其亚群Thl7细胞分化和致炎机能是否受到影响。通过此研究,我们希望发现GATA-3在哮喘发生过程中Th2/Th17淋巴细胞分化调控失衡现象中的作用及可能机制,以期为哮喘防治提供新思路和理论依据。目的通过补充完善急性哮喘动物模型评价标准,鉴定改良建立的急性哮喘小鼠模型是否成功。方法将35只SPF级BALB/c小鼠随机分为两组：急性哮喘组(20只)以OVA致敏、激发；正常对照组(15只)以等体积的PBS代替OVA致敏、激发；两组均在末次激发24 h后处理小鼠。处理包括：1.查看小鼠的一般行为活动；2.乙酰胆碱激发小鼠后,有创肺阻抗法测定小鼠的气道反应性；3. BALF行细胞学分类、计数；4.观察肺组织的病理变化；5.计算脾源性CD4+T细胞总数和Th17细胞的阳性率；6.测定BALF和脾源性CD4+T细胞培养上清中IL-4和IL-17的浓度。结果(1)急性哮喘组小鼠出现类似于人的哮喘发作症状,而正常对照组小鼠表现基本正常。(2)与正常对照组相比,急性哮喘组小鼠对乙酰胆碱的刺激反应明显,浓度反应曲线明显上移(P<0.01)。(3)急性哮喘组小鼠BALF白细胞总数及中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞的百分比明显高于正常对照组(P均<0.01)。(4)与正常对照组相比,急性哮喘组小鼠肺组织支气管及血管周围大量炎性细胞浸润(P<0.01)。(5)急性哮喘组小鼠脾源性CD4+T细胞总数和Thl7细胞阳性率明显高于正常对照组(P均<0.01)。(6)与正常对照组相比,急性哮喘组小鼠BALF和脾源性CD4+T细胞培养上清中IL-4和IL-17的浓度明显增高(P均<0.01)。结论(1)改良并建立了急性哮喘小鼠动物模型,并且模型鉴定成功。(2)成功完善了急性哮喘小鼠动物模型的评价标准。目的探讨急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞中RORγt表达的变化以及RORγt对急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞亚群Th17细胞分化和致炎机能的影响。方法首先研磨小鼠脾脏制成单细胞悬液后裂解红细胞,再予免疫磁珠分离小鼠脾源性CD4+T细胞,悬于加有胎牛血清的RPMI 1640培养液,加入ConA和PMA刺激培养24小时后行real-time PCR、Western blotting测定小鼠脾源性CD4+T细胞亚群Th17细胞中RORγt的表达,流式细胞仪测定Thl7细胞阳性率,ELISA法检测脾源性CD4+T细胞培养上清中IL-17的浓度,并分析急性哮喘组小鼠RORγt的表达与Th17细胞阳性率及IL-17浓度的相关性。结果(1)急性哮喘组小鼠脾源性CD4-T细胞RORγt的mRNA及蛋白表达明显高于正常对照组(P<0.01)。(2)急性哮喘组小鼠脾源性CD4+T细胞中Thl7细胞阳性率明显高于正常对照组(P<0.01)。(3)急性哮喘组小鼠脾源性CD4+T细胞培养上清中IL-17的浓度明显高于正常对照组(P<0.01)。(4)急性哮喘组小鼠脾源性CD4+T细胞中RORγt的mRNA表达与Thl7细胞阳性率、IL-17的浓度均呈正相关(r=0.854,0.872；P均<0.01)。(5)急性哮喘组小鼠脾源性CD4+T细胞中RORγt的蛋白表达与Thl7细胞阳性率、IL-17的浓度均呈正相关(r=0.902,0.891；P均<0.01)。结论(1)急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞中RORγt的表达显著增高。(2)急性哮喘小鼠脾源性Thl7细胞的分化和致炎机能显著增高。(3)急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞中RORγt的表达与Th17细胞的分化和致炎机能呈正相关。目的：通过RNA干扰GATA-3基因表达,观察急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞中RORyt的表达及其亚群Th17细胞分化和致炎机能是否受到影响。方法：通过基因瞬时转染的方法,将三对siRNA-GATA-3片段和阴性对照片段分别转染入急性哮喘组小鼠脾源性CD4+T细胞72小时后,进行RT-PCR和Western blotting检测GATA-3的表达,筛选出其中具有最佳沉默效果的片段。再将此片段转染入急性哮喘组小鼠脾源性CD4+T细胞,ConA和PMA刺激培养24小时后,行real-time PCR和Western blotting分别检测正常对照组小鼠、未转染siRNA组哮喘小鼠和转染最佳沉默片段siRNA组哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞中GATA-3和RORyt的表达,以及行流式细胞术和ELISA法分别检测Th17细胞阳性率和细胞培养上清中IL-17浓度,并分析转染最佳沉默片段siRNA组急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞中GATA-3的表达与RORyt的表达、Th17阳性率及IL-17浓度的相关性。结果：(1)在三对siRNA片段中以siRNA-GATA-3-201沉默效果最为明显(P<0.01)。(2)转染siRNA-GATA-3-201组急性哮喘小鼠的脾源性CD4+T细胞中GATA-3 mRNA的表达明显低于正常对照组小鼠和未转染siRNA组哮喘小鼠(P均<0.01)；转染siRNA-GATA-3-201组哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞中GATA-3蛋白的表达明显低于正常对照组小鼠和未转染siRNA组哮喘小鼠(P均<0.01)。(3)转染siRNA-GATA-3-201组急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞中RORγtmRNA的表达明显高于正常对照组小鼠和未转染siRNA组哮喘小鼠(P均<0.01)；转染siRNA-GATA-3-201组哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞中RORyt蛋白的表达明显高于正常对照组小鼠和未转染siRNA组哮喘小鼠(P均<0.01)。(4)转染siRNA-GATA-3-201组急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞中Th17的阳性率明显高于正常对照组小鼠和未转染siRNA组急性哮喘小鼠(P均<0.01)。(5)转染siRNA-GATA-3-201组急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞培养上清中IL-17的浓度明显高于正常对照组小鼠和未转染siRNA组哮喘小鼠(P均<0.01)(6)转染siRNA-GATA-3-201组急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞中GATA-3的mRNA表达与RORyt的mRNA表达、Th17阳性率及IL-17的浓度呈负相关(r=-0.622,-0.692,-0.877；P均<0.01)。(7)转染siRNA-GATA-3-201组急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞中GATA-3的蛋白表达与RORyt的蛋白表达、Th17阳性率及IL-17的浓度呈负相关(r=-0.894,-0.728,-0.886；P均<0.01)。结论：(1)RNA干扰技术可应用于支气管哮喘小鼠动物模型,实现对靶基因的沉默。(2)RNA干扰GATA-3基因表达可能促进急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞中RORγt的表达。(3)RNA干扰GATA-3基因表达可能促进急性哮喘小鼠脾源性Th17细胞的分化和致炎机能。(4)RNA干扰GATA-3基因表达可能通过促进急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞RORγt的表达进而促进Thl7细胞的分化和致炎机能。