【摘 要】
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毕赤酵母是现在广泛应用的、重要的外源基因表达宿主。本研究是本室毕赤酵母工程菌糖基化改造系列工作的必要组成部分。β-1,2-N-乙酰葡萄糖胺转移酶I(beta-1,2-N-acetylgluc
【出 处】
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中国人民解放军军事医学科学院 解放军军事医学科学院
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毕赤酵母是现在广泛应用的、重要的外源基因表达宿主。本研究是本室毕赤酵母工程菌糖基化改造系列工作的必要组成部分。β-1,2-N-乙酰葡萄糖胺转移酶I(beta-1,2-N-acetylglucosaminyltransferaseI，GnTI)是哺乳动物细胞糖蛋白N-糖链加工的关键酶之一，催化糖链由甘露糖型向杂合型转变。本研究将人的gnt1基因引入毕赤酵母宿主细胞，以期获得GnTI在宿主细胞内的表达，使酵母宿主胞具有合成杂合型糖链的能力。
首先用PCR方法调取人gnt1编码区DNA片段，用编码酿酒酵母MNN9高尔基体定位信号的114bpDNA序列替换人GnTI原有的高尔基体定位信号的编码序列，并在gnt1编码区的下游连接Myc表达标签的编码序列。将该DNA嵌合片段mnn9-gnt1-myc克隆至毕赤酵母表达载体pAO815，使其受控于表达载体醇氧化酶(AOX)启动子，得到毕赤酵母表达载体pAO815-mnn9-gnt1-myc(简称pAgm)，转化毕赤酵母GS115菌株，得到转化子GS115-pAgm。
以荧光物质氨基萘磺酸(ANTS)标记的甘露五糖(Man5GlcNAc2)和UDP-乙酰葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)为底物，检测转化子GS115-pAgm破菌上清液中GnTI的活性，反应产物进行荧光辅助糖电泳(Fluorophore-assistedcarbohydrateelectrophoresis，FACE)分析。电泳结果显示，经转化子GS115-pAgm破菌上清液作用的Man5GlcNAc2(ANTS)在PAGE电场的迁移速率变慢，表明反应后的寡糖分子量增大，变化量约为一个乙酰葡萄糖胺基团，显示已完成乙酰葡萄糖胺基团的加合，证明GS115-pAgm转化子破菌上清液具有乙酰葡萄糖胺转移酶活性。
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