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【背景】特异性阻断肿瘤血管生成的治疗是肿瘤治疗中的新思路，寻找肿瘤血管特异表达分子从而进行特异性肿瘤血管治疗具有十分重要的意义。2004年，我们实验室利用噬菌体环七肽库体内筛选技术，从人胃癌的小鼠肾包膜下异种移植瘤模型筛选出来的可以与人胃癌血管内皮细胞特异性结合的环状小肽GX1。目前该小肽已获得国家发明专利。CGNSNPKSC为其氨基酸序列。前期研究表明，GX1在体内外均具有良好的肿瘤靶向性并具有抑制血管生成的作用。但GX1靶向受体尚不明确，无法阐明其靶向性和发挥生物学活性的机制。前期，我们课题组利用人微血管内皮细胞cDNA文库法及免疫沉淀-质谱分析法对GX1的受体蛋白进行筛选和鉴定，但是由于各方面限制，如：技术条件不成熟，免疫沉淀条件摸索不成功，GX1短肽自身的亲和力低等的限制均没有取得成功。【目的】本实验旨在利用我科前期建立的人脐静脉内皮细胞永生化细胞系，继续优化免疫沉淀的条件筛选和鉴定肿瘤血管靶向肽GX1的结合受体。【方法】1.光镜及扫描电镜观察永生化内皮细胞（sv-HUVEC）的生长；免疫细胞荧光化学检测sv-HUVEC上的内皮细胞标志性分子CD31、FactorⅧ的表达；免疫细胞荧光化学检测GX1结合受体在sv-HUVEC细胞上的表达；收集sv-HUVEC全蛋白，以对照肽URP为阴性对照，用western blot方法检测GX1特异性结合蛋白所在分子量位置；2.采用免疫沉淀法、银染、质谱（MALDI-TOF/TOF）以及生物信息学分析筛选得到GX1结合受体的候选分子；3. Western blot检测候选分子在sv-HUVEC、胃癌细胞系SGC7901、正常胃黏膜上皮细胞系GES中的表达情况与GX1受体的表达是否一致；免疫细胞荧光化学及激光共聚焦检测候选分子与GX1受体在sv-HUVEC中的表达定位是否一致；免疫组织化学检测候选分子在连续胃癌组织切片中的表达定位是否一致；对免疫沉淀产物进行Western Blot分析，检测候选分子对GX1特异性结合蛋白的识别。【结果】1.光镜下，永生化内皮细胞生长状态良好，贴壁以后，细胞伸展完全，呈梭形或不规则多角形，部分密集区域细胞呈漩涡状生长。扫描电镜下观察sv-HUVEC细胞形态扁平，呈不规则形，细胞间连接紧密，表面有绒毛和突起。细胞免疫荧光化学显示，永生化内皮细胞表达内皮细胞特异性标志分子CD31和FactorⅧ；且GX1的结合受体在永生化内皮细胞上表达，主要定位于细胞浆和细胞膜，而其对照肽URP在sv-HUVEC上的表达较弱，因此永生化内皮细胞可作为GX1结合受体筛选的细胞模型。使用永生化内皮细胞全蛋白进行Western Blot，发现在Bio-GX1为1:10稀释浓度时，在90-130KD左右处有GX1特异性结合蛋白条带，而对照肽URP不结合于此处蛋白；给我们提示，Bio-GX1在1:10稀释浓度时，即0.1mg/mL时，为GX1受体筛选的最优条件；且GX1结合受体所在位置为90-130KD左右的蛋白条带所在位置；2.我们选用优化好的实验条件，选择sv-HUVEC细胞系，利用生物素标记GX1对GX1结合受体进行富集，选择对照肽富集蛋白作为阴性对照，对免疫沉淀产物经电泳分离后进行银染和Western Blot验证。银染结果显示，sv-HUVEC细胞系成功富集得到GX1特异性结合的蛋白条带，分子量在115KD左右，Western blot检测该条带能被GX1特异性识别。我们对富集得到的蛋白所在目的条带进行分离酶解及质谱检测，所得分子进行生物信息学分析，根据肽短匹配度大于2，以及GX1结合而URP不结合，以及受体的组织学分布、亚细胞定位、受体的分子量；结合两次质谱结果，得到两个重复出现的有意义候选分子：Integrin β1、Integrinα3；3.经鉴定，Integrin α3β1极有可能是GX1的特异性结合受体。Western Blot检测，GX1结合受体、 Integrin β1及Integrin α3在sv-HUVEC、SGC7901、GES细胞系中的表达，结果显示，三者在细胞中的表达情况基本一致，且其在永生化内皮细胞中的表达都高于SGC7901及GES；免疫细胞荧光及激光共聚焦结果显示，GX1结合受体、 Integrin β1及Integrin α3在sv-HUVEC细胞中具有良好的共定位；免疫组织化学检测结果显示，三者在多种连续胃癌组织中的表达情况模式相似；免疫沉淀结合银染、Western Blot检验Integrin β1及Integrin α3对Bio-GX1特异性结合蛋白的识别,结果显示，Integrin β1及Integrin α3均能识别Bio-GX1特异性结合蛋白。【结论】1.进一步证实了，人脐静脉内皮细胞永生化细胞系sv-HUVEC可以作为肿瘤血管靶向肽GX1受体筛选的细胞模型；2.免疫沉淀富集得到的分子量为115KD左右的条带，为Integrin β1及Integrin α3的前体所在位置。Integrin α3β1极有可能是GX1的受体蛋白，但仍需要进一步的验证。