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环境应激是危害畜禽生产的主要因素之一,常常会对畜禽生长发育、生产、免疫性能、产品质量等造成不利影响,进而引起巨大的经济损失。中药饲料添加剂具有多重功效,可在一定程度上解决因环境变化造成的上述问题。杜仲作为一种珍贵的药食两用植物,富含多种活性成分,具有较高的药用保健价值,在饲料添加剂生产中具有良好的应用前景。杜仲利用方式以取皮为主,杜仲叶一般废弃不用,资源丰富。杜仲叶中有效成分的分离制备和功能阐述是杜仲功能饲料添加剂研发和应用的基本前提。本文对杜仲叶活性成分(杜仲素)进行分离制备和雏鸡应激保护作用研究。主要研究结果如下:1.杜仲素提取工艺流程。通过单因素实验对料液比、提取时间和提取次数进行优化;通过正交实验获得最佳提取工艺参数:料液比1:32,提取时间2h,提取5次;该工艺所得杜仲素提取率为46.03%,绿原酸含量为21.06mg/g。优化建立工艺流程为:杜仲叶在80-90℃烘干→粉碎过80目筛→加入32倍体积蒸馏水浸泡2h→80-90℃水浴取2.5h→10000rpm,离心5min→上清液60℃烘干→粉碎过80目筛→杜仲素。2.杜仲素活性成分。采用LC-MS技术对制得杜仲素的生物学活性成分进行测定分析。在杜仲素中可检测到21种化学物质,包括6种环烯醚萜类、5种黄酮类、4种苯丙素类、2种木脂素类和4种其他物质,包括较高含量的车叶草苷酸(25.87mg/g)、绿原酸(16.92mg/g)、山奈酚(10.03mg/g)和桃叶珊瑚苷(7.87mg/g)等具有抗氧化作用的物质。3.杜仲素对热应激雏鸡的保护作用。采用“35-37℃_6h→23℃_18h”交替反复热应激处理雏鸡15d,实验组雏鸡日粮中添加0.8%杜仲素饲喂。对采食、生长发育、病理变化、抗氧化及免疫物质含量分析发现,杜仲素组雏鸡体重和日增重在15d时分别比对照组提高10.03%(P<0.05)和18.17%(P<0.05),料重比降低13.04%(P<0.05);实验组雏鸡心脏、脾脏、法氏囊、十二指肠、胰腺指数均较对照组高,发育未受到明显影响;热应激处理实验组雏鸡的心脏、十二指肠、肌胃的结构较为完整、炎症细胞较少,而同一时期对照组雏鸡各组织器官则出现较严重损伤;实验组血清中的T-AOC、SOD、GSH-PX分别提高了9.54%(P<0.1)、7.93%(P<0.05)、7.49%(P<0.05),MDA降低29.99%(P<0.05);血清中Ig A、Ig G、Ig M分别提高10.95%(P<0.05)、8.43%(P<0.05)、3.51%(P<0.05)。实验结果表明杜仲素对高温应激雏鸡具有良好的保护效果,可以改善高温对雏鸡生长发育的影响,减少环境应激导致的组织器官损伤,提高雏鸡抗氧化水平和增强免疫功能。4.杜仲素对冷应激雏鸡的保护作用。采用“10-14℃_6h→23℃_18h”交替冷应激处理雏鸡15d,实验组雏鸡日粮中添加0.8%杜仲素饲喂。对采食、生长发育、病理变化、抗氧化及免疫物质含量分析发现,杜仲素组雏鸡体重、平均日增重在15d时分别比对照组增加15.88%(P<0.05)和27.25%(P<0.05),料重比在7d时降低了32.81%(P<0.05);实验组雏鸡肝脏、法氏囊、十二指肠、胰腺指数高于对照组高;低温应激条件下雏鸡的心脏、十二指肠、肌胃结构较为完整、排列规则、炎症细胞较少,而对照组雏鸡各组织器官出现较严重损伤;血清中的T-AOC、SOD、GSH-PX分别提高了13.59%(P<0.05)、6.49%(P<0.05)、3.24%(P<0.1),MDA降低21.85%(P<0.05);血清中Ig A、Ig G、Ig M分别提高3.23%(P<0.05)、13.70%(P<0.05)、2.83%(P<0.05)。杜仲素饲喂可明显改善和降低低温应激对雏鸡的影响。5.杜仲素对雏鸡应激保护的分子机制。构建热应激和冷应激0d、11d、15d雏鸡脾脏的c DNA文库并进行转录组测序。GO和KEGG富集分析表明,热应激下,杜仲素组差异基因注释到免疫、防御相关的途径数分别为25条和7条,多与对照组;冷应激下,杜仲素组差异基因注释到免疫、防御、生长发育相关的途径数多与对照组,分别为16条、12条、3条。转录因子共表达分析表明,热应激和冷应激下杜仲素组雏鸡与免疫、生长发育相关的基因与Homeobox、CUT、TF-b ZIP、Frok_head、PAX、ZBTB、zf-MIZ等与生长发育及免疫调节相关的转录因子存在共表达。RNA-seq结果表明,饲喂杜仲素可通过启动免疫相关、生长发育、防御等通路基因转录,增强雏鸡分子调控功能,达到对雏鸡的应激保护调节。以上研究表明,杜仲素对高温和低温环境引起的雏鸡应激有明显的改善作用,能减少不良环境对雏鸡生长发育的影响,通过启动相关调控途径基因的转录,提高血清抗氧化物质含量和增强机体免疫功能实现其保护作用。研究结果为杜仲叶饲料添加剂的开发利用奠定了基础。