基于二维DNA支架的生物分子固定和检测

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纳米技术是当前世界上最具吸引力和前景的研究领域之一。它涉及材料、设备和系统三方面的设计、构建、表征和应用。纳米技术的主要目标是在0.1-100nm的范围内精确控制材料的结构,并使之兼具稳定而有用的特性。DNA纳米晶体自组装技术是N.C.Seeman教授首先提出的纳米自组装方法。它是由多条DNA单链,按照Watson-Crick的碱基配对原则,通过粘性未端自组装而成。其可程序化和在纳米尺度范围内的精确自组装的特性使DNA纳米晶体自组装技术倍受世人瞩目,它被认为是未来自下而上(bottom-up)分子器件和纳米制造术中的核心技术之一。DNA自组装可实现逻辑运算,也可作为支架来组装其它分子(纳米)线路或阵列,构筑特殊的分子或纳米器件如生物芯片或DNA计算机等。我的论文的主要工作是基于2D DNA支架的生物分子组装和检测。   将生物分子组装到二维DNA支架的一个前提条件是DNA支架上有与生物分子相互作用的位点,我们的想法是先合成带有特定位点的DNA轭合物,而这种DNA轭合物的分子结构最有效的鉴定工具是质谱。作为一种优越的质谱检测技术,基质辅助激光解吸/电离质谱(matrix-assisted LDI-MS)广泛地应用于生物分子的检测分析。而且,随着质谱技术的发展,越来越多的具有一定特性的纳米结构被当作样品靶或基质应用于激光解吸/电离质谱(LDI-MS)。   本论文分为两个部分。第一部分为:以沉积纳米金粒子的多孔硅表面作为样品靶,在不使用基质的情况下,该样品靶能增强分析物的激光解吸/电离的信号。这个分析方法为我们后面的DNA轭合物的表征做了铺垫。第二部分为:基于二维DNA支架的生物分子固定和检测。   第一部分:在不需要基质的情况下,以沉积纳米金粒子的多孔硅表面为样品靶,将之应用于PEG400,PEG2300,oxytocin和angiomax的激光解吸/电离质谱检测。与多孔硅解吸电离法(DIOS)比较,该样品靶能增强分析物的检测信号。这是因为多孔硅和纳米金粒子均在分析物的激光解吸/电离中起到重要的作用并对信号增强有贡献。此法兼具了DIOS和纳米金粒子的优点。   第二部分:为了将蛋白质固定于二维DNA支架上,我们在单链DNA上修饰不同的功能团。修饰的DNA可以通过基质辅助激光解吸/电离质谱技术进行表征。首先,我们对angiomax进行炔基修饰和对单链DNA进行叠氮基修饰,并将修饰后的angiomax通过Cu+催化[3+2]Huisgen环加成反应连接到DNA链,形成angiomax修饰的DNA链。Angiomax修饰的DNA链与其它10条DNA链一起通过碱基互补配对原则形成二维DNA支架。通过angiomax与antithrombin的相互作用,我们可以将antithrombin固定在这种含有angiomax阵列的二维DNA支架上。我们利用AFM表征了二维DNA支架上的angiomax条纹。除了大量的单层二维DNA支架外,我们还发现了具有纵向平行条纹的管状DNA结构(约占30%)。其次,我们以同样的化学连接方法将NTA修饰到了DNA链上,并将NTA修饰的DNA链与其它10条单链一起,形成含有NTA的二维DNA支架。在Ni2+离子的存在下,我们可以将组氨酸标记的蛋白质通过NTA与组氨酸的相互作用固定在带有NTA阵列的二维DNA支架上形成蛋白质阵列。理论上,通过加入咪唑溶液,可以从DNA支架上移走这种蛋白质阵列。最后,为了增加NTA与组氨酸标记的蛋白质之间亲和力的稳定性,我们合成了一个一端带有两个NTA、另一端带有叠氮基的化合物——N3-2NTA。在后续的研究中我们可以将N3-2NTA与炔基修饰的DNA相连接形成含有两个NTA的DNA链。带有两个NTA的DNA链将会更加牢固地将氨酸标记的蛋白质固定在二维DNA支架上。生物分子在DNA支架上的成功固定,将会促进生物医学(如药物—蛋白质、蛋白质—蛋白质、DNA——RNA和DNA——蛋白质)在纳米和次纳米尺寸下的发展。
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