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目的意义:血吸虫病(Schistosomiasis)人兽共患,危害严重。目前我国血吸虫病防治的难点是中间宿主钉螺难以消灭,重复感染严重,动物是血吸虫病的主要传染源,迫切需要加强血吸虫病免疫预防研究,建立更为特异、敏感的家畜血吸虫病诊断检测技术。曼氏血吸虫和日本血吸虫菲律宾株的研究结果表明血吸虫23KD抗原是很有发展潜力的候选疫苗抗原和诊断制剂。本研究针对在中国流行的日本血吸虫(中国大陆株),开展23KD抗原基因的克隆、表达,评估重组23KD抗原在小鼠和绵羊体内诱导的免疫保护作用,探讨免疫保护机制和提高免疫保护效果的有效途径;并以重组23KD抗原作为诊断试剂,建立黄、水牛和绵羊血吸虫病诊断检测的新方法,为我国血吸虫病防治提供新思路和新技术。 方法及结果:应用PCR技术首先克隆到编码日本血吸虫(中国大陆株)23KD抗原大亲水区多肽的DNA片段(Large hydrophilic domain of the Sj23,LHD-Sj23),在大肠杆菌系统中获得高效表达,免疫亲和层析获纯化产物,表达产量约占菌体总蛋白量的30-40%,融合蛋白分子量约为33.5KD。免疫分析表明该融合蛋白具有良好的抗原性和免疫原性。应用该融合蛋白免疫鼠血清进一步免疫筛选血吸虫成虫c-DNA文库,首次获中国大陆株23KD抗原全长编码基因,其开放阅读框内含657个碱基。同源性分析表明该DNA片段的核苷酸序列与菲律宾株相关序列的同源性为99.85%(656/657),氨基酸的同源性为100%;与曼氏血吸虫Sm23相比,核苷酸的同源性为80.37%(528/657),氨基酸的同源性为83.94%(183/218);与埃及血吸虫(Sh23)相比,核苷酸的同源性为80.21%(527/657),氨基酸的同源性为81.9%(177/218)。结构分析显示Sj23抗原含4个转膜区和2个亲水区,属TM4SF膜蛋白大家族成员。将Sj23基因与表达载体pMalP重组表达,免疫印迹转移试验表明重组抗原(66KD)存在于大肠杆菌产物的沉淀部分。 用LHD-Sj23/pGEX重组抗原免疫两批小鼠,和空白对照组相比,分别获得57.8%(p<0.01)和70.3%(p<0.01)的减虫率,和pGEX载体表达蛋白免疫组相比,减虫率分别为52.6%(p<0.05)和62~69%(p<0.01)。进行了一批绵羊免疫试验,LHD-Sj23/pGEX免疫组相对空白对照组获得了66.1%(p<0.0001)的减虫率,相对佐剂对照组获得了58.5%(p<0.005)的减虫率和58.4(p<0.005)的粪便虫卵减少率,表明该重组抗原可诱导较高的免疫保护作用,是一种值得深入研究的候选疫苗。 博【:学位论义 摘 要 中国农业科学院 免疫机理研究表明用 LHD-Sj23/pGEX免疫小鼠/绵羊后诱导了高水平的特异 性IgG抗体应答,特别以IgGZb抗体亚型的免疫应答最强。参照曼氏血吸虫23KD 抗原抗原表位的研究结果和日本血吸虫(中国大陆株)23KD抗原的氨基酸序列, 人工合成大亲水区多肽中一段含 T细胞和 B细胞表位的多肽 P14,与鸡血清白蛋 白pVA厂禹联后进行 了二批动物免疫试验,分别获得22.22%(p<0*5)干 3O.旧地p<0刀1)的减虫率,明显高于OVA免疫对照组获得的减虫效果,说明该合 成多肽的氨基酸序列是日本血吸虫(中国大陆株)23KD抗原的重要抗原表位之 O 为寻找提高基因工程疫苗免疫保护效果的可能途径,本研究先后进行了多价 基因工程疫苗、重组抗原与低剂量的血吸虫病治疗药物毗睦酮或细胞因子IL-2联 合防治血吸虫病的探索。结果在多价疫苗研究中,以 LHD-Sj23/pGEX和另一个日 本血吸虫基因重组抗原 SjFABP脂肪酸结合蛋白)联合免疫大鼠,相对空白对照组 和佐齐对照组分另获得47二8Wp<0刀1)和巧刀1Wp<0刀1)的减虫率,而单独用 LHD-Sj23/pGEX基因重组抗原免疫大鼠时,相对空白对照组和佐剂对照组获得的 减虫率为 32.14%和 29二1%,用 SjFABP免疫大鼠,相对空白组获得的减虫率为 引.85%,说明用这两种基因重组抗原联合免疫时,提高了兔疫保护作用。在重组 抗原和毗喳酮联合防治绵羊血吸虫病试验中人HD-Sj23/pGEX免疫组获得了 22.忙%的减虫率(p<0刀5),{剂量毗喳酮处理组获得*石%的减虫率(p<0刀5),而 重组抗原和低剂量毗喳酮联合使用获得了5a刀9%的减虫率…<0刀05X高于单独用 重组抗原兔疫或用毗喳酮处理组获得的减虫效果。此外重组抗原与重组的人IL2 联合免疫小鼠,或用质脂体包被后兔疫小鼠,未见增强免疫保护作用。 以重组抗原 LHD-Sj23巾GEX作为诊断抗原,应用 ELISA法检测黄、水牛和 绵羊血吸虫病,结果对黄、水牛的阳性符合率为 94.0009用4户 85.50O3历2), 阴性符合率为 82.7o侣旧8)和 95.loo7侣),对绵羊的阳性符合率为 86.940(if门 X 阴性符合率为1000仔p卜与以血吸虫成虫抗原pWP