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在原发性肝脏恶性肿瘤中,肝细胞性肝癌是我国最常见的类型,每年新发病例数居世界首位。目前临床常见的治疗手段包括肝脏肿瘤的根治性切除和肝移植、经肝动脉化疗和栓塞（TACE）、射频消融术、放射治疗、靶向治疗、免疫治疗等。尽管现在的治疗措施已经有了极大的进步,但肝癌患者的标准化死亡率高达15.9/10万,仅次于肺癌,5年生存率仅12%左右,因此肝癌的综合诊疗需要更多元化的治疗手段来有效延长患者的生存期。早期肝癌患者的5年生存率超过50%,而晚期患者不足10%,大部分患者就诊时已经失去手术机会,所以HCC诊疗工作中需要更加准确、多样化的生物标志物以提高肝癌的早期诊断率。作为近年来新发现的一种肿瘤相关LncRNA,PTTG3P已经在包括HCC在内的多种肿瘤中显示出作为新的预测因子和治疗靶点的潜能。近期研究虽然已经证明PTTG3P可作为HCC患者的独立预后因素,但其样本量较小,且未获得5年以上的生存数据,同时PTTG3P及其下游基因作用机理尚未阐明。综合以上几点原因,本研究首先通过生物信息学分析对PTTG3P的临床价值进行了验证,随后通过构建过表达及敲减细胞模型验证PTTG3P与肝癌恶性表型之间的关系,并从分子、细胞、动物及临床标本等多方面对PTTG3P的功能机制进行探索。1.PTTG3P在肝癌中的生物信息学分析虽然前人研究已经报道过PTTG3P与HCC细胞增殖、转移表型之间的关系,但其纳入的患者数量较少,且缺乏远期随访数据。鉴于此,我们利用TCGA-LIHC数据库中超过300例肝癌患者的临床样本及超过5年的随访数据对PTTG3P的预后价值及功能机制进行全面评估,结果显示PTTG3P在肝癌组织中存在特异性高表达,且与患者的临床期别、病理分度等情况明显相关。其次我们通过Kaplan-Meier生存曲线研究HCC患者PTTG3P表达量与OS和RFS的相关性后发现:PTTG3P高表达与HCC患者较差的OS和RFS相关,且可作为HCC患者预后的独立预测指标。最后我们利用String10.5及KEGG/GO等工具研究PTTG3P的下游调控网络及其相关功能后发现了 130个与PTTG3P具有共表达趋势的基因,这些基因主要参与细胞分裂、细胞周期、细胞因子等功能。2.PTTG3P敲减、过表达细胞模型构建及表型验证在第一部分生信分析的基础上,我们需要在细胞层面上进一步验证PTTG3P对HCC的影响。首先,我们从PTTG3P本底表达结果中选取最高的Hep3B和最低的HepG2两种细胞株构建稳转敲减和过表达模型。其次我们通过一系列表型实验发现:CCK8检测结果表明PTTG3P在肝癌组织中的表达量与细胞增殖成正比;流式凋亡实验显示PTTG3P表达量与HCC细胞凋亡成反比;流式周期实验表明PTTG3P表达量增高可使肿瘤细胞G1期比率减少,S期比率增加。此部分研究构建了PTTG3P过表达及敲减的稳转模型,验证了 PTTG3P与HCC细胞增殖、迁移的相关性,并为后续机制实验提供了细胞模型。3.PTTG3P促进HCC增殖、迁移的分子机制研究为了研究PTTG3P影响HCC恶性表型的分子机制,我们首先进行了荧光原位杂交（FISH）实验明确其亚细胞定位,结果提示Lnc RNA PTTG3P主要定位于细胞质中。接着我们利用RNA pulldown、质谱、RIP等实验找到了 PTTG3P的结合蛋白ILF2/ILF3复合体,同时我们将第二部分实验制备的PTTG3P过表达、敲减Hep3B细胞及各自对照细胞用于转录组测序,再综合生信分析及前人研究的测序数据得到了 5个潜在的PTTG3P、ILF2/ILF3下游基因,利用ChIP实验进行筛选后确定TOP2A为两者共同下游靶点。我们通过IF及WB实验证实当PTTG3P表达量下降时,ILF2存在由细胞质向细胞核迁移并与TOP2A启动子区结合的趋势,而ILF3的实验结果并未发现这种趋势,双荧光素酶报告基因实验也与此结论一致,并证明了 ILF2可促进TOP2A转录。在细胞质中,我们根据既往研究结果发现ILF2/ILF3可以增强mRNA的稳定性,并利用放线菌素D证实了 PTTG3P和ILF2可以使TOP2A mRNA的降解减缓。随后我们在动物实验中构建PTTG3P过表达、PTTG3P敲减、TOP2A敲减的裸鼠荷瘤模型并取得肿瘤组织进行免疫组化、Ki67及TUNEL检测后发现PTTG3P过表达可明显促进裸鼠肿瘤的增长,而PTTG3P敲减和TOP2A敲减则明显抑制其生长。HE和TUNEL染色结果提示PTTG3P及TOP2A敲减可明显抑制肿瘤的坏死及凋亡,而KI67染色则显示PTTG3P敲减组和TOP2A敲减组的细胞增殖水平明显降低。随后我们收集了 40例HCC患者的肝癌及瘤旁肝脏组织标本分别检测PTTG3P、TOP2A及ILF2表达情况,并收集患者的临床信息进行相关性分析,结果显示:PTTG3P与TOP2A及ILF2均存在正相关关系且三者在肝癌组织中均存在差异性高表达。PTTG3P表达量与患者AFP及HBsAg水平呈正相关,TOP2A表达量与患者AFP水平呈正相关,而ILF2表达量与患者CNCL分期呈正相关。最后我们将15例患者的肝癌标本及配对正常肝脏组织行HE及TUNEL染色后发现:肝癌组织中PTTG3P、TOP2A表达量较高时,肿瘤坏死与凋亡明显减少,而表达量较低时肿瘤坏死与凋亡的比例明显增高。