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猪支原体肺炎(Swine mycoplasmal pneumomia SWP)又称猪喘气病或猪地方性流行性肺炎,是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae Mhp)引起的一种接触性慢性呼吸道疾病,普遍存在于世界各地,是造成养猪业经济损失最重要的疾病之一。控制该病主要依靠弱毒疫苗和灭活疫苗,但是存在成本高效果低的缺点。本课题重点针对猪肺炎支原体P97蛋白的主要抗原决定区R1区的表达和猪肺炎支原体黏膜免疫特性开展研究,将具有黏膜免疫佐剂作用的不耐热肠毒素B亚单位(The B subunit of the heat-labile enterotoxin of Escherichia coli LTB)与具有气管纤毛结合表位的p97粘附因子的重复序列R1区进行重组,扩增得到重组序列LTBR1,构建原核表达质粒pET28a(+)-rLTBRl,为了对比免疫效果同时构建了原核表达质粒pET28a(+)-rR1。分别表达获得了两个与六个组氨酸融合表达的重组蛋白rLTBR1和rR1。采用亲和层析的方法对目的蛋白进行纯化。LTB的黏膜免疫作用需要检测该蛋白与受体神经节苷酯(ganglioside GM1)结合的亲和性。通过ELISA方法检测结果证明所表达的重组蛋白rLTBR1具有与受体GM1结合的高亲和性。通过SDS-PAGE和Western Blot试验对目的蛋白进行检测,鉴定,结果显示:表达的目的蛋白为特异性目的蛋白。为了研究rLTBR1蛋白在体内的免疫原性,将rLTBR1蛋白和对照蛋白rR1蛋白分别通过皮下和鼻内接种两个免疫途径免疫小鼠。通过ELISA试验检测免疫鼠血清中猪肺炎支原体p97粘附因子的抗体水平,结果证明:无论皮下接种还是鼻内接种rLTBR1蛋白,免疫鼠均可产生特异性抗猪肺炎支原体p97蛋白的抗体;皮下单独接种rR1蛋白同样可以产生特异性的抗rR1蛋白的抗体,然而鼻内单独接种rR1没有检测到特异性的抗体。通过ELISA方法检测黏膜抗体水平和脾细胞上清液中IFN-γ水平,鼻内接种rLTBR1蛋白产生了比较高的黏膜免疫抗体IgA,并且在鼻内免疫rLTBR1蛋白的小鼠脾细胞中诱导产生了IFN-γ,而皮下免疫rLTBR1蛋白组和鼻内,皮下免疫rR1蛋白组没有诱导机体产生有效的黏膜免疫抗体和细胞免疫。说明LTB利R1融合表达后可以更好的刺激小鼠的黏膜免疫和细胞免疫反应。本研究结果显示:LTB增强了猪肺炎支原体p97R1基因蛋白的黏膜免疫和细胞免疫作用。为猪肺炎支原体基因重组亚单位疫苗的研究奠定了重要的基础。