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P15INK4b抑癌基因是近年来发现的位于染色体9P21上的新型抑癌基因，其表达产物P15蛋白是参与细胞周期调控的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（CKI）的重要成员。P15INK4b抑癌基因的失活与白血病等多种肿瘤发生、发展密切相关。研究发现DNA的异常甲基化是引起P15INK4b抑癌基因失活的重要方式之一，其中较常见的是P15INK4b抑癌基因启动区5’—CpG岛的异常高甲基化，据报道高达86％的急性粒细胞白血病可存在DNA高甲基化。因此，针对P15INK4b抑癌基因的去甲基化治疗成为恶性血液病防治的一条新思路。本课题为此进行该方向的实验研究。 目前国际上研究较多的去甲基化药物是5-杂氮-2-脱氧胞嘧啶（5—aza—CdR）。本课题选用国内最早报道原用于诱导治疗的化学物质（As2O3）作为去甲基实验药物，开展对P15INK4b抑癌基因高甲基化的急性T淋巴母细胞白血病细胞系Molt-4细胞去甲基作用机制的实验研究，探讨As2O3对白血病细胞P15INK4B抑癌基因的去甲基化效果及同基因表达的关系，旨在探讨As2O3与白血病DNA甲基化的关系及其去甲基化治疗的可能机制，并为As2O3作为去甲基化药物提供实验依据。 本课题研究主要包括2个部分： 1、As2O3对Molt-4细胞P15INK4b抑癌基因DNA甲基化的影响：不同浓度（0μM、2.5μM、5.0μM和10.0μM）的As2O3与Molt-4细胞作用一定时间后，采用甲基敏感酶限制性酶切PCR（REP-PCR）比较加药前后P15INK4b抑癌基因DNA甲基化的改变;利用半定量RT一PcR法检测P 15’NK4b抑癌基因、DNA转移酶（DNMT一l）和DNA去甲基化酶（MBD一2）的mRNA表达的变化;甲基通过流式细胞仪和免疫细胞化学染色观察加药前后P15’NK4b蛋白表达的变化。以上分别从基因组DNA水平、mRNA转录水平和蛋白翻译水平反映As203对P15’NK4b抑癌基因甲基化和该基因表达的影响。结果表明:用药48小时后，P15基因甲基化明显减低至消失，其mRNA部分或完全恢复表达。P巧’NK4”蛋白表达阳性率及阳性强度均明显增强，2.5拼M、5，0林M和10.0协M AsZO3处理组表达分别增加33.49%、56.84%和69.21%（P<0.05），加药组与未处理组差别有显著性。此外，采用半定量RT一PCR法检测加药前后DNA甲基转移酶（DNMT一1）和DNA去甲基化酶（MBD一2）的mRNA表达情况，分析PI slNK4b抑癌基因甲基化与DNA甲基化模式的关键酶表达的相关性，以探讨AsZO3的去甲基化机制。结果显示:伴随P15’NK4b抑癌基因DNA甲基化的去除，DNMT一l表达下降，MBD一2表达增加。 2、AsZO3对Molt一4细胞增殖、活力和细胞周期的影响:不同浓度的AsZO3与Molt一4细胞作用一定时间后，通过克隆形成率、细胞计数和MTT法观察AsZO3对细胞增殖、活力的影响;通过流式细胞仪检测用药后Molt一4细胞周期的改变，以探讨AsZO3去甲基化对细胞的影响。结果表明:AsZO3使Molt一4细胞周期阻滞于GO、Gl期，且该增殖抑制作用具有时间和浓度依赖性。 结论:l、AsZO:可有效去除Molt一4细胞P15’NK4b抑癌基因甲基化，恢复该基因表达，阻滞细胞周期于GO、Gl期，抑制细胞增殖。2、AsZO3去甲基化机制主要是抑制DNMT一1表达、诱导MBD一2表达。