论文部分内容阅读
目的:用小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cell,mES)条件培养液(conditionmedium,CM)培养人脂肪干细胞(human adipose derived stem cells,hADSC),检测hADSC的增殖速率,试图找到一种能够促进hADSC快速增殖并不影响细胞性质的方法。方法:hADSC提取培养及鉴定——hADSC分离传代培养;MTT法检测hADSC的增殖活性;hADSC的细胞表面标记和细胞周期的流式细胞仪的检测;成骨成脂分化能力分别用茜素红和油红O染色进行鉴定。mES未分化状态的鉴定以及条件培养基的制备——mES培养液中添加LIF(leukemia inhibitory factor)培养在饲养层上传代,抑制细胞分化;mES的RNA提取后用PCR鉴定其多能性因子的表达情况;收集培养了未分化状态的mES24h后的培养液,过滤后即为CM培养液(condition medium)。CM培养液培养hADSC,检测生化分子指标——将hADSC分为三组,分别用hADSC培养液、40%CM培养液和40%ES培养液来进行培养,分为ADSC组,CM组,ES组。流式细胞仪检测三组细胞表面标记,PCR检测hADSC的细胞特异性表达基因c-kit和sca-1的表达用来鉴定细胞性质变化;用MTT检测三组细胞增殖速率,三组细胞计数制备生长曲线,通过流式细胞仪检测细胞周期;Q-PCR检测三组细胞多能性因子nanog,OCT-4的表达量;用PCR检测细胞凋亡标志基因caspase-3s,Q-PCR检测caspase-3的表达,流式细胞仪检测P3、P15代的hADSC的凋亡;用Q-PCR检测hADSC成骨分化0d、7d、14d的ALP,collagen type I,OPN,RUNX-2的标志基因的表达量的检测,细胞在诱导21d时进行茜素红的染色;hADSC成脂诱导分化14d后进行油红O染色。结果:1.MTT结果显示,hADSC增殖曲线呈S形,增殖情况良好;流式细胞仪检测表面因子表明CD29、CD44、CD73、CD90和CD105表面标记阳性表达,而CD31、CD34、CD45和HLA-DR表面标记因子阴性表达;流式细胞仪检测hADSC细胞周期表明(87.3±0.48)%的细胞处于G1期、(5.3±0.84)%的细胞处于G2期以及(7.4±0.35)%的细胞处于S期;茜素红S染色,油红O染色结果显示hADSC具有向成骨和成脂分化的能力,符合间充质干细胞的基本性质。2.mES的细胞集落呈圆形突起状生长,球形饱满,克隆的边缘光滑且细胞核质比高,有较好的折光率。其多能性基因nanog、OCT-4、sox-2高表达。收集该细胞状态下的ES细胞培养24h后的培养液,0.22um的滤器过滤除去其中可能混有的胚胎干细胞。3.流式细胞仪检测三组表面标记结果显示,经CM培养后的ADSC,其阳性表达细胞表面标志CD29,CD44,CD73,CD90,CD105表达量无变化,阴性表达的表面标志CD31,CD45表达量降低,HLA-DR表达量增加;PCR结果显示c-kit与Sca-1的表达量均表达,无差异;MTT法检测细胞增殖速率,40%CM组MTT吸光值显著高于ADSC组(P=0.012<0.05),细胞计数的结果显示CM组的细胞增长速率显著高于其他两组,流式细胞仪检测细胞周期,显示CM组处于S期的百分数高于其他两组,间接显示CM组细胞增殖速度快;Q-PCR结果显示,OCT-4表达量,CM组,ES组表达量显著高于ADSC组,nanog的表达,CM的表达量显著高于ES组,ADSC组,结果表明CM培养液能够增加hADSC的多能性;PCR结果显示Caspase-3的表达量CM组显著低于ADSC组,P=0.003<0.01差异极显著,流式细胞仪检测细胞凋亡,显示CM组的细胞凋亡比率低于ADSC实验组,说明CM培养液能够抑制hADSC凋亡;ALP及COL I的表达量,诱导七天时表达量最高,ALP:7d的表达量与0d、14d有显著性差异,0d、7d、14d组间无差异。COL I:ADSC组CM组,7d与0d、14d有显著性差异,组间无差异。OPN与RUNX-2是成骨分化晚期表达的基因,诱导14d的ADSC组和ES组OPN及RUNX-2的表达量显著高于CM组。结论:1.胚胎干细胞条件培养液(ESC-CM)能够显著的提高hADSC的增殖速率。并不影响hADSC的细胞性质。2.胚胎干细胞条件培养液(ESC-CM)能够增加nanog,OCT-4的基因的表达量,增加了hADSC的多能性,并且能够抑制hADSC的凋亡。3.在成骨成脂诱导分化中,成骨早期表达的基因组间没有明显的差异,但是晚期表达的基因如OPN,RUNX-2表达量,CM组明显低于其他两组。但诱导28d的hADSC经过茜素红S染色后,钙结节数目无明显的差异,说明CM培养液增加了hADSC的原始性。