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第一部分CRH通过上调E-cadherin表达抑制TGF β1诱导的乳腺癌细胞上皮向间质转化进程促肾上腺皮质激素释放激素(Corticotropin-Releasing Hormone, CRH)家族肽主要成员包括CRH, Urocortin (Ucnl), Urocortin2(Ucn2)和Urocortin3(Ucn3),与之相结合的受体有两种亚型即促肾上腺皮质激素释放激素一型受体(Corticortropin-Releasing Hormone Receptor type1, CRHR1)和促肾上腺皮质激素释放激素二型受体(Corticortropin-Releasing Hormone Receptor type2, CRHR2)。研究表明,外周CRH相关肽对肿瘤细胞的凋亡及增殖发挥着举足轻重的作用,但对其转移的作用及机制尚未明确。上皮向间质转化(Epithelial mesenchymal transition, EMT)是具有极性的上皮细胞转换成具有活动能力的间质细胞并获得侵袭和迁移能力的过程。目前为止,转化生长因子(31(Transforming growth factor β1, TGFβ1)是公认的EMT诱导因子,其具体机制主要是通过诱导转录调节因子Snaill和Twistl从而抑制上皮钙粘蛋白(E-cadherin)的表达。E-cadherin的下调是发生EMT的标志性变化。研究影响TGFβ1诱导EMT的物质及其相关机制能够更深入地了解EMT,从而干扰肿瘤的侵袭转移。本部分实验我们采用两种乳腺癌细胞系(MCF-7, MDA-MB-231)作为研究对象,采用Transwell小室,Western blot及Real-time PCR等方法,探讨了CRH对TGFβ1诱导EMT的作用及其具体机制。实验结果表明CRH通过下调Snaill和Twistl的表达,上调E-cadherin的表达,最终抑制乳腺癌细胞的迁移。进一步的实验结果表明在MCF-7细胞株中,CRH通过激动CRHR1和CRHR2两种受体抑制TGFβ1介导的EMT,而在MDA-MB-231细胞株中只通过激动CRHR2起作用。为了进一步证实每种受体对TGFβ1介导的EMT的确切作用,我们采用HEK293细胞,分别导入CRHR1或CRHR2,再给予CRH刺激,发现转入两种受体的细胞与未转染细胞相比高表达E-cadherin。此外,CRH还能够抑制间充质标记N钙粘蛋白(N-cadherin)的表达,诱导闭合蛋白(Occludin)的表达。综上所述,实验结果表明,CRH主要通过激动CRHR1及CRHR2抑制TGFβ1介导的EMT。此研究有助于揭示CRH在乳腺肿瘤发生、侵袭与转移中的重要影响。第二部分Urocortin对血管内皮细胞I CAM-1表达调节的机制研究Urocortin(Ucnl)作为CRH家族肽的成员之一,有报道指出参与炎症反应。血管内皮细胞中细胞间粘附因子-1(Intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)表达的上调在炎症反应过程以及免疫性疾病中起着重要的作用。我们之前的研究发现,Ucnl能够上调ICAM-1的表达,但Ucnl上调ICAM-1的具体机制尚未明确。本部分实验采用人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)探讨Ucn1增加ICAM-1表达的具体机制。我们研究发现,Ucn1能激活CRHRl和CRHR2增加胞浆型磷脂酶A2(Cytosolic phospholipases A2, cPLA2)的表达以及磷酸化水平。我们运用环加氧酶2(Cyclooxygenase-2, COX-2)以及CRHR的阻断剂表明Ucn1能够通过激活COX-2上调ICAM-1的表达,并且Ucn1是激活CRHR2增加COX-2的表达,CRHR2阻断剂Antisauvagine-30(Anti-30)几乎消除这一作用,而CRHRl阻断剂Antalarmin (Anta)对其无明显影响。Ucnl能增加COX-2下游产物前列腺素E2(Prostaglandin E2, PGE2)的合成,与相应的膜受体结合后激活蛋白激酶A-cAMP反应元件结合蛋白(protein kinase A-cAMP response element binding protein, PKA-CREB),从而进一步增加ICAM-1的表达。为了证明在Ucn1的刺激下,COX-2可被cPLA2直接调节,我们采用cPLA2阻断剂pyrrophenone (PYR)或siRNA的方法干扰cPLA2。结果表明,PYR阻断或siRNA干扰cPLA2能够减少COX-2的激活及PGE2的产生,而这两者是ICAM-1表达升高的必需条件。此外,干扰cPLA2后能够阻止Ucnl引起的PKA-CREB信号通路的激活。有趣的是,两个受体都能够激活cPLA2,这项研究中Ucn1只是通过CRHR2增加cPLA2依赖性的ICAM-1表达。Ucn1通过CRHR1激活cPLA2的机制仍不十分明确。综上所述,Ucnl通过CRHR2激活CPLA2-COX-2-PGE2-PKA-CREB信号通路增加内皮ICAM-1的表达。