【摘 要】
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目的:实现梅花鹿基质金属蛋白酶-2催化域(Catalytic domain of matrix metalloprotease2,cdMMP-2)的体外表达,为进一步研究基质金属蛋白酶-2催化域结构功能及产品开发应用奠定基础。方法:采用RT-PCR方法从鹿茸cDNA中扩增MMP-2的催化域基因,运用Nde I和Not I克隆位点连入原核表达载体pET30a中,构建原核表达质粒并转化到大肠杆菌BL2
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目的:实现梅花鹿基质金属蛋白酶-2催化域(Catalytic domain of matrix metalloprotease2,cdMMP-2)的体外表达,为进一步研究基质金属蛋白酶-2催化域结构功能及产品开发应用奠定基础。方法:采用RT-PCR方法从鹿茸cDNA中扩增MMP-2的催化域基因,运用Nde I和Not I克隆位点连入原核表达载体pET30a中,构建原核表达质粒并转化到大肠杆菌BL21中,利用IPTG引导目的蛋白表达,通过使用金属螯合层析技术和柱上复性方法来纯化和复性目的蛋白,利用酶解底物法检测酶的活性。结果:1.重组表达的cdMMP-2 C端带有6×His标签,共有377个氨基酸,预测大小为42.04kD,理论等电点为4.95;2.cdMMP-2转化到感受态细胞BL21中并成功表达cdMMP-2蛋白,优化出最佳IPTG浓度为0.6 mM,最佳诱导时间为5 h;3.经过SDS-聚丙烯酰胺电泳检测和免疫印迹分析,发现目的蛋白主要表达在包涵体中。使用金属螯合层析技术纯化目的蛋白,柱上复性后由SDS-PAGE电泳检测,结果显示目的蛋白单一条带;5.测得蛋白浓度为2.0 mg/mL;6.通过酶解底物实验,证明目的蛋白具有显著的胶原水解活性。结论:本研究通过构建原核表达体系获得了高纯度,高效率,高活力的cdMMP-2。
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