研究背景：食品化学污染物是食源性疾病的重要病因之一,食品化学污染物包括重金属、农药、毒素以及食品加工过程中形成的有毒有害物质等,然而,人们以往对这些物质对机体健康影响的研究往往过多关注其对健康影响的传统毒性,对其潜在危害如：免疫系统、内分泌系统和神经发育系统等特殊毒性影响却研究不多。丙烯酰胺是高温烹饪的淀粉类食品中常见的食品内源性污染物之一,已有大量研究数据显示,丙烯酰胺具有神经毒性、发育毒性和生殖毒性,而有关免疫毒性缺乏系统性研究；因此本研究对丙烯酰胺的免疫毒性从体液免疫、细胞免疫、非特异性免疫等几方面进行了系统研究。2014年国家食品安全风险评估专家委员会也将丙烯酰胺列为优先评估项目,将对丙烯酰胺进行重新评估,目前正广泛收集丙烯酰胺的相关毒性资料,本研究结果也将为丙烯酰胺对健康影响的风险评估提供毒理学的科学数据。随着科学技术的快速发展和生活水平的提高,消费者对食品的要求也逐步提高,药食两用物质由于其具有提高机体免疫力和特殊的营养功效,受到各国食品行业的青睐。然而药食两用物质虽然具有较高的开发和利用价值,但是由于其成分的复杂性,如果大量服用,均可引发潜在危害甚至死亡,因此药食两用物质进行安全性评价的同时,也需要关注其神经毒性、免疫毒性、内分泌干扰作用等特殊毒性,从而为该类物质作为新药开发或者保健型食品的开发提供科学依据。苦瓜是近年来备受关注的药食两用物质之一,然而大部分研究多集中于对苦瓜及其提取物的功效研究方面,对于苦瓜及其提取物对免疫毒性的研究报道还很少,因此本研究选择苦瓜提取物作为受试物,全面评价苦瓜提取物对BALB/c小鼠免疫功能的影响。机体的免疫系统是毒性物质最直接的攻击目标,继而引发机体出现不良反应,包括健康并发症如：易感性增加、癌症、过敏性反应和自身免疫性疾病的产生等等,因此在外源性化学物诱发机体出现一些不良反应之前,免疫系统已经表现为受到损害(淋巴结细胞构成改变、淋巴细胞亚群改变、宿主抵抗力下降、特异性免疫功能应答改变等),因此免疫系统的毒性改变是某些外源性化学物安全性评价中较为敏感的指标,对物质进行免疫毒理学评价是十分必要的。研究目的：(1)参照ICH提出的免疫毒性评价指导原则,通过体液免疫、细胞免疫、非特异性免疫及附加免疫学实验的检测指标,对丙烯酰胺的免疫毒性进行评价,并且初步探究了丙烯酰胺的免疫毒性靶点及其可能的毒性机制,完善其免疫毒理学资料,并为今后对丙烯酰胺对健康的风险评估提供科学数据。(2)参照ICH提出的免疫毒性评价指导原则,通过体液免疫、细胞免疫、非特异性免疫及附加免疫学实验的检测指标,对苦瓜提取物进行免疫毒性评价,为进一步评价苦瓜提取物的食用安全性评价提供免疫毒理学资料。研究方法：(1)丙烯酰胺对BALB/c小鼠免疫毒性的研究选用雌性BALB/c小鼠,动物经适应性饲养3天后按体重将动物随机分组,每组动物10只,按组分笼饲养,每笼5只动物。试验周期为30天。共5个免疫组,分别用于一般毒性和免疫病理学检测、体液免疫实验、细胞免疫实验及附加免疫实验；每个免疫组设5个试验组,即阴性对照组(蒸馏水)、丙烯酰胺低剂量组、中剂量组、高剂量组及阳性对照组(环磷酰胺)。一般毒性和免疫病理学指标：小鼠体重、免疫器官及其它脏器的重量及脏器系数；血液学指标；血生化指标；肝脏、肾脏、脾脏、胸腺、淋巴结(颈部淋巴结、腋下淋巴结、耳部淋巴结、肠系膜淋巴结、Peyer氏淋巴结)、骨髓的组织病理学观察。体液免疫包括：T细胞依赖性抗体反应(测定脾空斑形成细胞数,PFC)、血清溶血素的测定和血浆免疫球蛋白水平(酶联免疫吸附法法测定血浆IgA、IgM口IgG水平)。细胞免疫包括：ConA诱导的脾T淋巴细胞增殖试验和LPS诱导的脾B淋巴细胞增殖试验。非特异性免疫包括：NK细胞活性的测定和巨噬细胞功能的测定(小鼠碳廓清试验)。附加免疫实验指标：血清细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、IFN-γ、TNF的测定,外周血淋巴细胞表型分析包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、Th细胞、Ts细胞比例,这两种检测均采用流式细胞技术。(2)丙烯酰胺免疫毒性机制的初步探讨选用雌性BALB/c小鼠,动物经适应性饲养3天后按体重将动物随机分组,每组动物10只,按组分笼饲养,每笼5只动物。试验周期为30天。设5个试验组,即阴性对照组(蒸馏水)、丙烯酰胺低剂量组、中剂量组和高剂量组,以及阳性对照组。试验结束后,取各组脾脏和胸腺组织,并将脾脏和胸腺切分为两部分,一部分使用液氮冻存备用；另一部分以4%甲醛固定作病理分析。通过TUNEL法检测脾脏和胸腺中的细胞凋亡水平；RT-PCR方法检测脾脏、胸腺中Bax、Bcl-2、caspase-3、PARP的mRNA水平,通过Western blotting方法检测脾脏、胸腺中Bax、Bcl-2、caspase-3、PARP的蛋白表达水平。(3)苦瓜提取物对的BALB/c小鼠免疫毒性的研究选用雌性BALB/c小鼠,动物经适应性饲养3天后按体重将动物随机分组,每组动物10只,按组分笼饲养,每笼5只动物。试验周期为30天。共5个免疫组,分别用于一般毒性和免疫病理学检测、体液免疫试验、细胞免疫实验及附加免疫实验；每个免疫组设5个试验组,即阴性对照组(蒸馏水)、苦瓜提取物低剂量组、中剂量组、高剂量组及阳性对照组(环磷酰胺)。一般毒性和免疫病理学指标：小鼠体重、免疫器官及其它脏器的重量及脏器系数；血液学指标；血生化指标；肝脏、肾脏、脾脏、胸腺、淋巴结(颈部淋巴结、腋下淋巴结、耳部淋巴结、肠系膜淋巴结、Peyer氏淋巴结)、骨髓的组织病理学观察。体液免疫包括：T细胞依赖性抗体反应(测定脾空斑形成细胞数,PFC)、血清溶血素的测定和血浆免疫球蛋白水平(酶联免疫吸附法法测定血浆IgA、IgM和IgG水平)。细胞免疫包括：ConA诱导的脾T淋巴细胞增殖试验和LPS诱导的脾B淋巴细胞增殖试验。非特异性免疫包括：NK细胞活性的测定和巨噬细胞功能的测定(小鼠碳廓清试验)。附加免疫实验指标：血清细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、IFN-γ、TNF的测定,外周血淋巴细胞表型分析包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、Th细胞、Ts细胞比例,这两种检测均采用流式细胞技术。研究结果：(1)环磷酰胺作为阳性对照物的研究结果：本研究中采用环磷酰胺作为阳性对照物,其一般毒性指标和免疫病理学指标的结果显示环磷酰胺阳性对照组peyers结个数减少,脾脏绝对重量和相对重量、胸腺绝对重量较阴性对照组显著性降低。组织病理学检测显示阳性对照组；动物脾脏出现中度萎缩,髓外造血减少,淋巴小结内生发中心缩小或消失；胸腺出现中或轻度萎缩；Peyer氏淋巴结萎缩,滤泡结构不清,生发中心缩小或消失；骨髓造血细胞减少,且骨髓组织中分叶核细胞比例增加,其余各系细胞减少。血液学结果显示,阳性对照组白细胞数、平均红细胞体积、淋巴细胞、淋巴细胞百分比较阴性对照组显著降低,平均血红蛋白浓度、血小板平均体积、血小板分布宽度、单核细胞百分比、中性粒细胞百分比较阴性对照组显著增高；血生化结果显示阳性对照组血清血清白蛋白、血清白球比较阴性对照组显著降低,血清总胆固醇较阴性对照组显著升高。细胞免疫检测结果显示：阳性对照组ConA和LPS诱导的脾淋巴细胞增殖能力与阴性对照组比较显著降低,体液免疫检测显示,溶血空斑数、血清HC50值、血浆IgG和IgM水平较阴性对照组显著降低。外周血淋巴细胞分型结果显示,阳性对照组小鼠全血总T淋巴细胞(CD3+CD19-)百分比、CD4+T淋巴细胞百分比以及Th/Ts比例均显著高于阴性对照组；B淋巴细胞(CD3-CD19+)百分比显著低于阴性对照组。血清细胞因子检测结果显示,阳性对照组小鼠血清IL-6水平显著低于阴性对照组。(2)丙烯酰胺对BALB/c小鼠的免疫毒性研究结果：丙烯酰胺的试验结果如下,丙烯酰胺高剂量组第1周、第2周、第3周、第4周体重均显著低于阴性对照组,终体重、peyers结个数、肾脏绝对重量、脾脏绝对重量和相对重量、胸腺绝对重量和相对重量与阴性对照组相比显著降低,组织病理学检测显示丙烯酰胺高剂量组：动物脾脏白髓萎缩,其余动物脾脏组织结构清晰,红髓、白髓及边缘区清晰,未见明显异常。胸腺出现轻度萎缩,淋巴结(颈部、腋下、耳部、肠系膜淋巴结),淋巴滤泡萎缩；peyers结及骨髓组织未见异常；丙烯酰胺低剂量组与中剂量组各组织均未见异常。血液学结果显示,丙烯酰胺中剂量组红细胞数、血红蛋白、红细胞压积、红细胞分布宽度较阴性对照组显著降低；丙烯酰胺高剂量组红细胞数(血红细胞宽度、平均血红蛋白浓度、红细胞分布宽度、淋巴细胞数、淋巴细胞百分比、单核细胞百分比较阴性对照组显著降低,丙烯酰胺高剂量组平均红细胞体积较阴性对照组显著升高；其余指标各剂量组与对照组比较无统计学意义。血生化结果显示,丙烯酰胺高剂量组血清总蛋白、血清白蛋白、总胆固醇较阴性对照组显著增高,血清甘油三酯较阴性对照组降低。细胞免疫检测结果显示：丙烯酰胺高剂量组小鼠脾T细胞增殖能力较阴性对照组显著降低。体液免疫检测显示,丙烯酰胺高剂量组血清HCso值较阴性对照组显著降低。丙烯酰胺不同剂量组对NK细胞活性无明显影响。丙烯酰胺三个不同剂量组小鼠全血T淋巴细胞(CD3+CD19-)百分比均显著高于阴性对照组。外周血淋巴细胞分型结果显示,丙烯酰胺高剂量组CD4+T淋巴细胞(CD3+CD4-)百分比明显高于阴性对照组；丙烯酰胺三个剂量组小鼠全血NK细胞百分比均显著低于阴性对照组。血清细胞因子检测结果显示,丙烯酰胺高剂量组小鼠血清IL-6水平显著低于阴性对照组；丙烯酰胺高剂量组小鼠血清IL-17水平显著高于阴性对照组；丙烯酰胺低剂量和中剂量组血清IFN-y水平显著高于阴性对照组和高剂量组。(3)丙烯酰胺对BALB/c小鼠免疫毒性的机制研究：Tunel法检测结果显示,丙烯酰胺中、高剂量组动物脾脏、胸腺的细胞凋亡率显著高于阴性对照组；阳性对照组动物脾脏细胞凋亡率显著高于阴性对照组；RT-PCR检测结果显示脾脏组织中丙烯酰胺低剂量组及高剂量组Caspase-3的mRNA水平显著低于阴性对照组,阳性对照组Caspase-3的mRNA水平显著高于阴性对照组；而胸腺组织中丙烯酰胺低剂量组和阳性对照组PARP的nRNA水平显著高于阴性对照组。其它各组中Bcl-2、Bax、Caspase-3、PARP基因表达水平与阴性对照组均未见显著差异。Western blotting检测结果显示脾脏组织中丙烯酰胺中剂量组Bcl-2蛋白表达水平较阴性对照组显著升高、阳性对照组Bax、PARP蛋白表达水平较阴性对照组显著下降,丙烯酰胺各剂量组及阳性对照组Caspase-3蛋白表达水平较阴性对照组显著降低；胸腺组织中丙烯酰胺各剂量组和阳性对照组Bcl-2蛋白表达水平较阴性对照组显著降低,丙烯酰胺中、高剂量组及阳性对照组PARP蛋白表达水平较阴性对照组显著降低,丙烯酰胺各剂量组和阳性对照组Caspse-3蛋白表达水平较阴性对照组显著降低,丙烯酰胺中剂量组及阳性对照组Bax蛋白表达水平较阴性对照组显著降低。(4)苦瓜提取物对BALB/c小鼠的免疫毒性研究结果：一般毒性指标和组织病理学检测,苦瓜提取物各剂量组动物终体重、Peyer氏淋巴结数、脏器重量、肝体比、肾体比、脾体比及腺体比与阴性对照组比较均无显著性差异；苦瓜提取物各剂量组对BALB/c小鼠肝脏、肾脏、脾脏、胸腺、淋巴结及骨髓无影响,血常规和血生化指标未见影响。体液免疫检测显示,苦瓜提取物中剂量组小鼠血清IgG水平高于阴性对照组,苦瓜提取物高剂量组小鼠血清IgA水平高于阴性对照组。细胞免疫检测显示,苦瓜提取物低剂量组ConA诱导的脾淋巴细胞增殖能力较阴性对照组显著升高。外周血淋巴细胞分型结果显示,苦瓜提取物受试物中剂量组NK细胞(CD3-CD49+)百分比显著低于阴性对照组。血清细胞因子检测结果显示,苦瓜提取物低剂量组IL-6、IL-4、TNF水平显著高于阴性对照组。研究结论：(1)本研究为国内外首次对丙烯酰胺的免疫毒性进行系统评价,研究发现丙烯酰胺对免疫器官脾脏、胸腺、淋巴结均有明显的毒性作用,对一些免疫病理学、细胞免疫、体液免疫指标有明显抑制作用,但未见其对非特异性免疫功能有明显毒性作用。在本研究试验条件下,丙稀酰胺在低剂量时即可观察到小鼠的全血T细胞和NK细胞比例显著降低以及血清细胞因子IFN-y显著升高,可以初步得出丙烯酰胺的LOAEL为4mg/kgBW。(2)凋亡通路可能是丙烯酰胺导致小鼠免疫器官出现损伤的重要作用途径,是其产生免疫毒性作用的机制之一。丙烯酰胺对免疫系统产生毒作用的机制可能是通过其诱导脾脏和胸腺组织中Caspase-3蛋白的过度活化,并且抑制了胸腺组织Bcl-2的正常表达,使Bcl-2和Bax的相互协调作用失衡,导致脾脏和胸腺细胞过度凋亡,使脾脏和胸腺出现萎缩,最终引发免疫功能出现障碍；然而该过程中还有许多分子机制的参与,因此今后还需进一步对丙烯酰胺长期暴露对机体的影响以及全面的分子机制进行探讨。(3)本研究为国内外首次对苦瓜提取物的免疫毒性进行系统评价,在本研究剂量范围内,苦瓜提取物对正常BALB/c小鼠的免疫功能无明显毒副作用,苦瓜提取物对小鼠血清免疫球蛋白IgA、IgM的产生,以及细胞因子IL-6、IL-4的分泌有明显的促进作用,苦瓜提取物低剂量组ConA诱导的脾淋巴细胞增殖能力较阴性对照组显著升高,说明苦瓜提取物对小鼠的细胞免疫、体液免疫有一定的调节作用。