核仁是核糖体RNA(r RNA)基因存储、rRNA合成、加工以及核糖体大小亚单位的装配场所,并参与核内蛋白降解、凋亡、应激、细胞增殖调控、肿瘤发生等多种重要的生理过程。核仁定位蛋白12(nucleolar location protein 12,NOL12)是一种新发现的核仁定位蛋白,能够与rRNA结合,参与rRNA的转录和加工。已有的研究发现果蝇的NOL12同源体Viriato直接参与果蝇眼睛的生长和分化,并且在果蝇胚胎发育中作为果蝇癌基因Myc(drosophila Myc,dMyc)的下游蛋白对细胞的生长、分化和存活起促进作用。对大鼠NOL12的核仁定位机制研究发现,NOL12的核仁定位序列可能位于其蛋白的C末端。目前关于人类NOL12蛋白的亚细胞水平空间分布、定位机制研究以及其在细胞中所发挥的作用还并不深入。本研究通过生物信息学分析对人NOL12可能存在的核仁定位序列进行了预测,根据预测结果将人全长NOL12分解为多个片段,分别构建与GFP重组的融合蛋白表达质粒,转染HeLa细胞。通过观察GFP在亚细胞水平的荧光定位发现:人NOL12存在着3段相对独立的核仁定位信号序列,分别位于其N端的1-10,C端166-184,C端187-213号位氨基酸残基之间,而其他区域的重组蛋白未见明显核仁定位。同时又对NOL12可能存在的核定位序列也进行了预测,预测可能存在核定位序列的区域与核仁定位序列所在的区域存在重叠性。由于单个GFP分子量太小,能自由扩散入核,因此我们根据预测结果分段构建了与三荧光串联蛋白CCG(Cherry-Cherry-GFP)重组的融合蛋白。荧光观察Cherry在亚细胞水平的定位发现:人NOL12确实存在2段相对独立的核定位信号序列,分别位于其N端的1-20和C端的166-213号位氨基酸残基之间,并且位于C端的核定位能力更强。在进行NOL12亚细胞定位机制研究的同时,我们也对其生物学功能进行了检测。通过过表达和小分子RNA干扰的方式检测了NOL12对人宫颈癌细胞株He La细胞的增殖能力、细胞活力等方面的影响。结果显示:过表达NOL12可促进HeLa细胞的增殖能力,使其处于S期的细胞比例均显著增加,沉默NOL12则显著抑制He La细胞的增殖能力。为了使NOL12在HeLa细胞中能够稳定表达以更好地研究NOL12的生物学功能,我们构建了能表达NOL12与GFP融合蛋白的稳转细胞株;同时,为了避免融合时GFP分子对NOL12的结构和功能产生影响,我们构建了GFP分别在NOL12 C端和N端融合的细胞株以及小标签蛋白HA与NOL12融合的细胞株。这些稳转细胞株均能够提高HeLa细胞的单克隆集落生成率和无血清培养下的细胞迁移能力。这些现象表明,人NOL12确能参与调控He La细胞的增殖生长,并对HeLa细胞的迁徙能力具有促进作用。由于HeLa细胞来源于宫颈癌,为了明确宫颈癌组织中是否存在NOL12表达水平的变化,我们对多个临床宫颈癌样本的病理组织切片进行免疫组织化学检测NOL12表达量变化。结果显示:相对于癌旁组织,宫颈癌巢中的NOL12免疫反应性显著增高,且NOL12分布在增殖能力强、分化较低的基底层细胞胞质,而在增殖能力弱、分化较高的棘层细胞中则分布于核仁。我们为了明确NOL12发生的这种空间分布转移现象以及总表达量增高的现象是否与HeLa细胞的增殖能力有关,我们用含高浓度血清(30%)或含有表皮生长因子(EGF)的培养基进行增殖刺激情况下,观察到He La细胞中的总NOL12蛋白水平的显著增加,并且出现由胞核向胞质转移的现象。由此提示,人NOL12的蛋白水平和空间移位与宫颈癌的发生和发展明显相关,同时NOL12由胞质向胞核转移是宫颈癌恶性程度的一个相关因素。本项研究首次确定了NOL12的核仁/核定位序列的位置,同时发现了在宫颈癌组织中NOL12表达水平增高以及空间转位现象;过表达NOL12可以显著促进He La细胞的增殖与迁徙能力。这些结果表明,NOL12有可能是宫颈癌治疗的一个新的靶点。我们的实验结果为将来系统研究NOL12亚细胞空间定位以及NOL12与宫颈癌发生的关系提供新的证据。