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甲型副伤寒沙门氏菌(副甲菌)是革兰氏阴性菌,该菌广泛分布在自然界中,属于危害性极大的肠道致病菌。副甲菌会引起副伤寒病症,常出现的症状为腹痛、发烧以及脾脏肿大等,严重者可导致死亡。病原菌进入人体的第一道关卡就是先天性免疫,吞噬细胞在先天免疫中发挥着举足轻重的作用,入侵的绝大多数病原菌都会被吞噬细胞杀灭,而副甲作为胞内寄生菌,能够在吞噬细胞内生存,并被吞噬细胞携带到人体其他部位进而传播开来,研究其中的机制有助于针对性的防控副甲的播散。NO是吞噬细胞杀灭内吞菌的重要武器,已有研究报道,鼠伤寒沙门氏菌与大肠杆菌细胞内的操纵子norRVW能够产生功能分子,分解吞噬细胞内的NO,而针对副甲菌的相关研究并未见报道,为此本研究拟针对norRVW与副甲致病性进行初步探索。本文依据副甲菌CMCC50973基因组(GI:CP009049)中norRVW操纵子内norT、norV、norW的序列,设计引物分别扩增其同源臂(R12、R34、V12、V34、W12、W34),融合PCR将相应的两个上下游同源臂进行融合,得到敲除同源融合臂(R14、V14、W14),TA克隆并鉴定正确后,Bgl Ⅱ酶切回收同源融合臂,与相同酶切的自杀性载体pYG4连接,转化至S17-1λpir。鉴定后的阳性菌株经接合转移将重组质粒转移到利福平抗性副甲菌50973(Rif+)中,进行对应基因的缺失突变,由此获得基因缺失突变菌:50973(△norR)、50973(△norV)以及50973(ΔnorW)。同时,扩增包括启动子与终止子在内的norR片段,与T载体pMD19T vector(simple)连接后转化至50973(Rif+)中,构建norR过表达菌50973(NorR)。为了研究norW、norW对副甲致病性的影响,将75只雌性BALB/c小鼠随机分为对照组 50973(Rif+)与四个实验组 50973(ΔnorR)、50973(△norV)、50973(ΔnorW)、50973(NorR),每组再随机分为三小组,每小组含小鼠5只,分别在小鼠腹腔内注射105、106、107的对应细菌,记录注射后72小时小鼠存活情况,比较不同菌株的致死力。由此计算出各菌株的 LD50:LD50/50973(Rif+)=1.25× 106,LD50/50973(ΔnorV)=1.99×106,LD50/50973(△norW)=1.99X 106,LD50/50973(ΔnorR)>3.16×107,LD50/50973(NorR)=1.77×105。结果表明:相对于 50973(Rif+)组,50973(ΔnorV)与 50973(ΔnorW)致死力略微减弱,50973(ΔnorR)致死力显著减弱,50973(NorR)致死力明显增强。从存活率最高组各取三只,测定小鼠脾脏中的单位菌量,比较不同菌株的生存力。各菌株经腹腔注射72 h后在脾脏中的存活量分别为:50973(Rif+)=1.89× 104±1.97× 104,50973(△norV)=1.08× 104±536.69,50973(△norW)=5.89×104± 5.27×104,50973(△norR)=0±0,50973(NorR)=5.03×103±2.31×103。结果表明:相对于 50973(Rif),50973(△norV)与 50973(△norW)生存力下降,50973(△norR)生存力几乎为 0,50973(NorR)生存力提高。为了研究norR、norV、norW之间的关系,于对数生长期分别提取前述五株菌的总RNA,以5SrRNA为内参,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定:50973(Rif+)、50973(△norV)、50973(ΔnorW)中 norR的转录水平;50973(Rif+)、50973(ΔnorR)、50973(NorR)中 norV转录水平;50973(Rif+)、50973(△norV)、50973(NorR)中 norW的转录水平,以2-ΔΔCt法进行相对定量分析。结果表明:1)norV与norW的缺失会引起norR转录水平增加,提示在副甲菌中,norV与norW的减少会反馈到细菌调节系统中,从而使细胞norR转录增强;2)norR的缺失会引起norV与norW转录水平的下降,而norR的过表达会引起与norV与norW转录水平的增加,提示在副甲菌中,norR正向调节norV与norW的转录。综上所述,本研究分别构建了 norR、norV、norW基因缺失突变菌和norR过表达菌;细菌的致死力与生存力的研究表明,操纵子norRVW能够影响细菌致病性,其中norR表现为甚;qRT-PCR结果提示,norR正调控norF、norW转录,后者对前者存在负反馈。这些初步研究结果为深入研究norRVW调控以及它们在抵抗宿主天然免疫的作用奠定了基础,也为副甲菌的治疗、防控提供了新的思路。