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本研究运用RAN干扰、Western bloting、细胞培养、流式细胞仪等细胞学分子生物学技术,通过在体、离体实验,研究了PP2A活性与Erk1/2信号转导在hsBAFF激活B淋巴细胞增殖中的作用;通过使用钙离子螯合剂或CaMKⅡ抑制剂,进一步探讨了hsBAFF上调B淋巴细胞[Ca2+]i与PP2A活性表现以及Erk1/2激活的关系,本研究旨在为理解BAFF调节体液免疫机制和相关疾病的防治提供理论基础和科学依据。结果如下: 1、hsBAFF通过抑制PP2A激活Erk1/2促进B细胞增殖 在体小鼠实验,选取40只ICR健康小鼠,雌雄各半,随机分成对照组和4个不同剂量hsBAFF处理组,每组8只。处理组每日按照含hsBAFF0.1、0.5、1和2 mg/kg体重的PBS溶液进行腹腔注射,对照组注射同等剂量的PBS溶液。在注射8天后,用抗CD19磁珠分离纯化脾脏B淋巴细胞。离体细胞实验,分别接种6、24或96孔培养板的Raji细胞和/或分离纯化原代B淋巴细胞,用0-5μg/mlhsBAFF处理12或48 h、或用2.5μg/ml hsBAFF处理0-24 h。以上实验分析细胞增殖活性、PP2A和Erk1/2蛋白表达变化。采用Ad-MKK1-R4F、Ad-MKK-K97M感染Raji细胞分别持续激活或钝化MKK活性,或用Ad-PP2A-wt感染Raji细胞过表达PP2A,论证PP2A-Erk1/2信号级联在hsBAFF促进B细胞增殖中的作用。结果显示: hsBAFF注射小鼠8天后,脾脏B淋巴细胞增殖活性呈现剂量依赖性升高,并且可见PP2A去甲基化和磷酸化及Erk1/2磷酸化也呈hsBAFF剂量依赖增加。离体实验显示,hsBAFF促进B细胞增殖与其抑制PP2A活性导致Erk1/2磷酸化增加有密切关系。这被持续激活MKK1强化hsBAFF诱导Erk1/2磷酸化和B细胞增殖作用,而钝化MKK1使得hsBAFF诱导Erk1/2磷酸化和增殖减弱,以及PP2A过表达部分地阻止hsBAFF激活Erk1/2和B细胞增殖证据支持。提示:hsBAFF通过抑制PP2A激活Erk1/2促进B细胞增殖。 2、hsBAFF通过Ca2+-CaMKⅡ依赖抑制PP2A诱导Erk1/2激活和B细胞增殖 将培养的Raji细胞接种于6或24孔培养板,在1和2.5μg/ml hsBAFF单独作用及与抑制剂联合作用12h或48 h,各种抑制剂BAPTA/AM、EGTA、2-APB或KN93在加hsBAFF前预处理1h。Western blot检测PP2A活性和Erk1/2激活状态、细胞计数评估B细胞增殖表现。结果显示:BAPTA/AM、EGTA或2-APB削弱hsBAFF抑制PP2A活性,进而降低Erk1/2磷酸化和B细胞增殖,表明hsBAFF抑制PP2A激活Erk1/2和B细胞增殖是Ca2+依赖的。CaMKⅡ抑制剂KN93通过削弱hsBAFF诱导PP2A活性抑制明显阻止Erk1/2磷酸化和B细胞增殖,表明hsBAFF刺激CaMKⅡ抑制PP2A激活Erk1/2和B细胞增殖。本研究提示:hsBAFF通过Ca+-CaMKⅡ依赖抑制PP2A诱导Erk1/2激活和B细胞增殖。