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研究目的胃癌是常见的恶性肿瘤之一,已严重影响了人类健康。目前外科手术是治疗胃癌的主要手段,但许多胃癌患者在确诊时已发生了周围脏器的浸润和转移,丧失了手术治疗的机会。探讨胃癌侵袭转移的分子机制,寻求与胃癌转移有关的有效分子检测靶标是临床亟待解决的问题。癌相关成纤维细胞(cancer associated fibroblasts,CAFs)是肿瘤微环境中最主要的间质细胞成分,与肿瘤的侵袭转移密切相关。最近研究发现,微小RNA(micro RNA,mi RNA)与癌细胞增殖、凋亡及侵袭转移等生物学行为密切相关。但mi RNAs在胃CAFs中的表达情况及具体生物学功能尚不清楚。因此,本研究旨在明确胃CAFs与NFs中mi RNAs的差异表达情况,根据检测结果进一步研究在胃CAFs和NFs中表达差异最显著的mi RNA-214对成纤维细胞激活蛋白(fibroblast activation protein,FAP)表达的调节作用,探讨其维持CAFs活性的影响,并初步明确mi RNA-214对胃癌细胞迁移和侵袭生物学行为的作用和机制,为阐明胃癌的侵袭转移机制和寻找新的治疗靶点提供理论依据。研究方法1.利用酶消化原代培养法培养胃黏膜正常成纤维细胞(normal fibroblasts,NFs)和CAFs,并通过细胞形态观察、免疫细胞化学、transwell实验等方法对原代培养纯化的胃NFs和CAFs细胞进行鉴定。2.利用real-time PCR方法检测多种mi RNAs在胃NFs和CAFs细胞中的相对表达水平;根据检测结果,采用瞬时转染技术将mi RNA-214的模拟物(mi RNA-214mimic)和阴性对照转染至CAFs细胞中并检测其转染效率,然后利用real-time PCR和western blotting方法检测CAFs中mi RNA-214表达水平的改变对FAP基因在RNA和蛋白水平的调控作用,探讨mi RNA-214对CAFs活性的影响。3.将mi RNA-214 mimic和阴性对照转染至CAFs细胞并收集条件培养液,采用transwell实验分析CAFs中mi RNA-214表达水平改变对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响;并通过生物信息学软件和real-time PCR初步预测mi RNA-214的靶基因。研究结果1.已纯化的NFs细胞形态比较规则,体积较小,呈长梭形;而CAFs细胞虽呈长梭形,但胞突较多,形态大小不等,排列紊乱。免疫细胞化学鉴定结果表明,原代培养的胃NFs和CAFs细胞均表达间叶细胞标志物Vimentin,但都不表达上皮细胞标志物Cytokeratin。FAP作为CAFs重要的特异性标志物,在CAFs中的表达水平明显高于NFs。Real-time PCR和western blotting结果同样证实CAFs中FAP在RNA和蛋白水平上的表达都显著高于NFs。Transwell迁移和侵袭实验结果显示,与NFs组相比,CAFs组穿过基质胶或滤膜的MGC-803和SGC-7901细胞数显著增多。2.Real-time PCR结果显示,18种与肿瘤间质细胞相关的mi RNAs在胃CAFs与NFs中的表达均具有差异性,其中mi RNA-214在NFs和CAFs中的表达差异最显著;mi RNA-214在CAFs中的相对表达水平约是NFs中的1/4;CAFs细胞转染mi RNA-214 mimic和阴性对照后,real-time PCR结果显示实验组中mi RNA-214的表达水平约是阴性对照组的96.1倍,表明转染成功。进一步研究结果显示,与阴性对照组相比,mi RNA-214上调组中FAP在RNA和蛋白水平的表达都有降低。3.CAFs细胞转染mi RNA-214 mimic和阴性对照后,transwell实验结果显示与阴性对照组相比,mi RNA-214上调组穿过基质胶或滤膜的MGC-803和SGC-7901细胞数减少。进一步生物信息学软件筛查和real-time PCR结果显示,FGF9有可能是mi RNA-214调控的靶基因之一。研究结论1.与NFs相比,CAFs在细胞形态、免疫表型及生物学功能等方面均发生了显著变化,在胃癌迁移和侵袭过程中发挥促进作用。2.mi RNAs在胃CAFs与NFs中的表达具有差异性,其中mi RNA-214在CAFs中的表达水平显著降低;上调CAFs中mi RNA-214的表达可抑制FAP的表达,提示mi RNA-214可影响CAFs的活性。3.上调CAFs中mi RNA-214的表达可显著降低胃癌细胞MGC-803和SGC-7901的迁移和侵袭能力,mi RNA-214可能通过下调FGF9的表达从而在胃癌恶性进展过程种发挥抑制作用。