目的:通过H₂O₂干预BRL-3A大鼠肝细胞建立体外大鼠肝细胞氧化应激损伤模型并予以药物干预,观察胰岛素信号通路因子AKT,P-AKT, FoxO1蛋白的表达和FoxO1乙酰化水平变化,及对糖异生的影响,从新的角度探讨氧化应激诱导胰岛素抵抗的可能机制。方法:体外培养正常大鼠肝细胞（BRL-3A）,生长达60-70%融合后,无血清培养进同步化24h随即分为5组:1.正常细胞环境组:A:空白对照组:10%FBS的DMEM培养24小时;B:尼克酰胺（NAM组）:含尼克酰胺10mmol/L的培养基作用24小时;2:氧化应激模型组:C: H₂O₂组:含100umol/l H₂O₂培养基培养4小时;D: H₂O₂+尼克酰胺（NAM）组;E:H₂O₂+还原性谷胱甘肽（GSH）（D组和第E组先用含100umol/l的H₂O₂培养基培养4小时后再分别予以10mmol/l尼克酰胺培养液和5mmol/l还原性谷胱甘肽培养液培养24小时）,以上每组细胞干预培养液中均含有100nM胰岛素。Western印迹法（WB）定量检测各组细胞AKT,P-AKT, FoxO1蛋白表达水平,免疫沉淀（IP）和WB检测各组FoxO1蛋白乙酰化水平,RT-PCR检测糖异生关键酶PEPCK和G-6-Pase基因表达水平。结果:（1）氧化应激细胞模型建立:100umol/l的H₂O₂干预细胞后,细胞MDA含量随时间延长逐渐增加,2 h后MDA含量增加最为显著,呈现明显的细胞损伤效应。（2）实验各组AKT,P-AKT,FoxO1,乙酰化FoxO1蛋白表达水平的变化:各组细胞AKT蛋白表达量无明显差异;氧化应激细胞模型各组（C,D,E组）FoxO1蛋白表达量明显高于正常细胞环境组（A,B组）,差异具有统计学意义（P<0.01）,但模型组组内差异不显著（p≥0.05）;与空白对照组相比,尼克酰胺组P-AKT蛋白和乙酰化FoxO1蛋白均有所增加,H₂O₂组（C组）两者表达量均最低（P<0.01）;与H₂O₂组相比,H₂O₂处理后再予以尼克酰胺干预,细胞P-AKT和乙酰化FoxO1蛋白有不同程度的增加（P<0.01）,予以还原性谷胱甘肽干预细胞P-AKT蛋白水平有所增加,但FoxO1蛋白表达及乙酰化水平无明显变化。（3）各组PEPCK和G-6-P mRNA的表达情况:与空白对照组相比,尼克酰胺组的PEPCK和G-6-Pase mRNA表达明显减少（P<0.01）,H₂O₂组PEPCK和G-6-Pase mRNA表达最高（P<0.01）;与H₂O₂组相比,H₂O₂+尼克酰胺组和H₂O₂+还原性谷胱甘肽组PEPCK和G-6-Pase基因表达有不同程度降低（P<0.05）。结论:（1）100umol/l的H₂O₂可以对体外培养BRL-3A大鼠肝细胞造成氧化损伤,损伤程度成时间依赖性。（2）尼克酰胺不影响FoxO1蛋白表达水平但能明显增加其乙酰化水平,抑制糖异生关键酶基因PEPCK,G-6-Pase表达,改善胰岛素抵抗,间接证实SIRT1去乙酰化FoxO1增加FoxO1活性。（3）氧化应激能够增加FoxO1蛋白的表达水平,并通过激活SIRT1间接降低FoxO1蛋白乙酰化水平,增加糖异生关键酶基因PEPCK,G-6-Pase表达,促进肝脏糖异生,导致胰岛素抵抗,这可能是氧化应激诱导胰岛素抵抗的分子机制之一。另外本实验意外发现氧化应激同时能降低FoxO1上游因子P-Akt蛋白表达水平,说明氧化应激可以影响胰岛素信号通路多个环节导致胰岛素抵抗。（4）本实验意外发现尼克酰胺可以增加细胞FoxO1上游因子P-Akt蛋白表达水平。提示尼克酰胺改善胰岛素抵抗可能是从多水平上实现的。抗氧化剂（GSH）可以显著降低氧化应激状态下糖异生关键酶基因PEPCK,G-6-Pase表达,提示抗氧化剂（GSH）可以改善胰岛素抵抗,该作用实现可能与其可以增加P-Akt蛋白表达有关。