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肿瘤细胞基因突变,特别是糖酵解中的丙酮酸激酶肌肉同工酶剪切变构体突变,可导致葡萄糖有氧糖代谢途径的明显改变,即Warburg效应:肿瘤细胞在氧气充足条件下仍将绝大部分葡萄糖进行无氧酵解,产生大量ATP维持自身代谢需求。为满足生物大分子合成的需求,肿瘤细胞摄入大量谷氨酰胺,在线粒体内经谷氨酰胺酶催化生成谷氨酸进而转化成α-酮戊二酸以补全三羧酸循环,即谷氨酰胺酵解。抑制谷氨酰胺酵解途径的关键起始酶和限速酶-谷氨酰胺酶的活性即可达到抑制肿瘤细胞生长的目的。本文成功克隆表达人源谷氨酰胺酶蛋白,在新合成检测试剂EZMTT的基础上成功建立谷氨酰胺酶活性测试方法,由此进一步筛选出有效的谷氨酰胺酶抑制剂,并通过新的活性检测方法证实了化合物依布硒啉为谷氨酸脱氢酶抑制剂而非谷氨酰胺酶抑制剂,具体主要包括:1.采用TA克隆方法从A549 cDNA中成功得到目的基因,并设计特异性引物,经PCR扩增得到的目的产物与质粒pET 22b连接,成功构建C-端His-taq标签的工程菌。重组质粒pET 22b-hKGA转化至宿主大肠杆菌BL 21中,1:20比例接种扩培,在OD600达到0.4时加入终浓度1 mM的IPTG诱导3小时,利用Ni柱亲和层析纯化蛋白。菌体超声破碎后,SDS-PAGE鉴定表达蛋白主要存在于上清液中,且分子互作结果表明有含His-taq标签的蛋白与NTA结合。上清液过镍柱分离纯化,经SDS-PAGE确定其分子量为56 k Da。2.基于四氮唑-甲臜-NAD（P）H体系,实验室自主合成新型单磺酸四氮唑盐化合物-EZMTT,建立了一种全新的谷氨酰胺酶活性测试方法,并对检测试剂EZMTT的有效性进行考察。EZMTT本身在450 nm左右无明显吸收,而被NAD（P）H还原生成的甲臜在450 nm处有强吸收;相较于WST-8,EZMTT氧化电位更低,不易被还原剂（β-巯基乙醇,EGCG）还原而产生假阳性;EZMTT试剂对洗涤剂Tween 20（0-0.2%）及变性试剂SDS（0-1%）具有较好的耐受性,且相较于广泛应用的WST-8,EZMTT稳定性更好。同时,以EZMTT试剂为检测试剂,成功克隆表达N-端His-taq标签的大肠杆菌来源谷氨酸脱氢酶并建立其活性测试方法,在此基础上进一步建立谷氨酰胺酶的活性测试方法,并对方法进行条件优化。3.以依布硒啉为例,将建立的谷氨酰胺酶活性测试方法与文献报道的谷氨酸氧化酶偶联法进行比较。纸层析结果表明依布硒啉对KGA催化Gln水解为Glu的反应无抑制作用;证实依布硒啉为一类谷氨酸脱氢酶抑制剂而非谷氨酰胺酶抑制剂,进一步证明利用谷氨酸氧化酶偶联法得到的依布硒啉抑制谷氨酰胺酶的活性是检测方法造成的假阳性。同时本文对谷氨酸氧化酶偶联法的检测条件进行了系统的考察,包括谷氨酸脱氢酶,谷氨酸氧化酶,辣根过氧化酶,强氧化剂H2O2。HPLC分析发现依布硒啉与双氧水反应;TMB显色反应结果说明依布硒啉对辣根过氧化酶也有抑制作用。4.基于新建立的酶活性测试方法筛选高效的谷氨酰胺酶抑制剂。实验室自主合成100种谷氨酰胺酶抑制剂,其中化合物HJ2抑制效果略低于已知的BPTES;HJ 7是双靶标的新型谷氨酰胺酵解阻断剂,可同时抑制谷氨酰胺酶（IC50为0.2μM）和谷氨酸脱氢酶（IC50为0.32μM）的活性;HJ 14对谷氨酸脱氢酶均有较好的抑制作用（IC50分别为0.035μM）;HJ 3,HJ 8,HJ 9,HJ 15,HJ 48,HJ 49,HJ 50,HJ 51,HJ 60,HJ 81均表现出一定的谷氨酰胺酶和谷氨酸脱氢酶抑制作用。