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目的：
通过理论研究初步提出较为系统的AD病变全过程的病机演变规律，探析由因虚生热和痰瘀化热导致的“热”推动AD病变发展这一重要病机，及AD病理变化的四个关键过程：“虚生痰瘀-痰瘀化热-热结酿毒-毒损脑络”，探讨AD病理进程中的“热”和“毒”的理论内涵，梳理痰瘀同治、清热解毒法防治AD的理论依据。
通过实验研究探索建立稳定可靠的AD-痰瘀互结病证结合动物模型，解析痰瘀同治、清热解毒法对AD-痰瘀互结病证结合动物模型的干预作用及其可能的作用机制，阐明痰、瘀在AD的病理变化过程中存在“化热”这一关键过程，并尝试揭示“痰瘀化热酿毒”“毒损脑络”的生物学过程以及“热”和“毒”可能的生物学基础，初步证实痰瘀同治、清热解毒法可通过调控HSP70介导的神经保护机制发挥改善脑神经炎症、改善海马神经元突触结构和可塑性、抑制神经元凋亡等作用。
方法：
1、理论研究方法：
以《古今图书集成医部全录》、《四库全书》子部、《中华医典》(第5版)为主要工具，综合古今医家之言，系统梳理虚、痰、瘀及痰瘀互结、化热酿毒、毒损脑络这些因素和环节与AD的关联，整理中医学对AD病变全过程的病机演变认识，探析“热”和“毒”的理论内涵，梳理痰瘀同治、清热解毒法防治AD的的理论依据。
2、实验研究方法：
①以3月龄APP/PS1双转基因小鼠作为AD的疾病模型动物，用D12492高脂饮食饲喂，改变其血脂指标，以模拟中医“痰”证的病理状态；用0℃冰水浴处理，改变其血液流变指标，以模拟中医“瘀”证的病理状态；二者结合模拟同时存在“痰”“瘀”的病理状态，分别建立AD-痰、瘀、痰瘀互结病证结合动物模型。通过比较各组小鼠的学习与记忆能力，舌色客观变化，以及血脂、血液流变学、脑神经炎症、AD相关病理变化的指标来评价模型，探索建立稳定可靠的AD-痰、瘀、痰瘀互结病证结合动物模型。
②复制AD-痰瘀互结证病证结合动物模型，分为5个组：不予给药处理的模型组、给予痰瘀同治的益智温胆汤组、给予清热解毒的黄连解毒汤组、同时给予痰瘀同治和清热解毒的益智温胆汤+黄连解毒汤组，以及作用机制对照药物替普瑞酮组，并以同系遗传背景的非转基因C57小鼠作为空白对照组，分别处理40天。Morris水迷宫法检测各组小鼠学习记忆能力；刚果红染色法、甘氨酸镀银染色法、透射电镜法、高尔基染色法等方法分别观察各组小鼠海马区SP、NFTs、神经元超微结构变化、突触和树突棘的改变等；使用免疫荧光标记法，WesternBlot法检测各组小鼠海马组织内相关蛋白的表达和共定位关系，比较各组小鼠的病理改变、脑神经炎症、凋亡、突触、线粒体功能等的变化情况。
结果：
1、实验一结果
①Morris水迷宫：与AD-Model组比较，各组小鼠的平均游泳速度差异无统计学意义。Control组小鼠游泳总路程和上平台潜伏期明显更短，穿越平台次数明显更多，其余各组小鼠的游泳总路程、上平台潜伏期和穿越平台次数差异无统计学意义。
②舌色对比：与AD-Model组小鼠相比，Control组小鼠舌色偏淡红，其余各组小鼠舌色偏暗红。AD-Pbs组小鼠的舌色r值最小。
③血液流变学指标检测：与AD-Model组小鼠相比，Control组小鼠全血黏度和血浆黏度更低。其余各组小鼠的全血黏度和血浆黏度均有不同程度升高。而与AD-Model组小鼠相比，AD-Bss组和AD-Pbs组小鼠的全血黏度和血浆黏度更高。
④血脂指标检测：与AD-Model组小鼠相比，Control组小鼠血脂指标差异无统计学意义。其余各组小鼠的血脂指标均有不同程度升高，与AD-Model组小鼠相比，AD-Ps组和AD-Pbs组小鼠的各项血脂指标更高，但其差异不具有统计学意义。
⑤WesternBlot：与Control组小鼠相比，各组小鼠的海马组织TNF-α、IL-1β和T-Tau均明显升高。与AD-Model组小鼠比较，AD-Pbs组小鼠海马组织中的TNF-α、IL-1β和T-Tau的差异具有统计学意义。
2、实验二结果：
①Morris水迷宫：与Control组比较，各组小鼠游泳总路程和上平台潜伏期明显延长，穿越平台次数明显减少。与Model组比较，各组小鼠平均游泳速度差异无统计学意义，各给药组小鼠游泳总路程和上平台潜伏期均缩短，穿越平台次数有不同程度的增加。
②跳台实验：与Control组比较，各组小鼠潜伏期明显缩短、出错次数增加；与Model组比较，各给药组小鼠潜伏期延长、出错次数减少。
3、实验三结果：
①刚果红染色：Control组小鼠海马区和皮层中几乎没有观察到SP，而Model组小鼠海马区和皮层中散在分布着许多SP，各给药组SP均有不同程度的减少。
②甘氨酸银浸镀：与Control组小鼠相比，Model组小鼠海马区染色明显加深，镜下可见大量被染成黑色条状的NFTs，以CA3区最为明显；各给药组小鼠海马区的NFTs有不同程度减少。
③透射电镜：Control组小鼠海马神经元细胞结构完整，染色质团聚在核内，线粒体丰富，核糖体和粗面内质网均匀散在分布在胞质中。Model组小鼠海马神经元出现细胞死亡现象，镜下可见细胞核塌陷，边界破解甚至消失，染色质固缩或消失，视野内可见若干凋亡小体分布，线粒体数量明显减少，且大部分线粒体出现肿胀甚至破裂，粗面内质网结构松散，仅可见少量零星分布的核糖体。各给药组小鼠海马神经元也存在不同程度的损伤，但细胞核整体形态正常、结构完整，镜下可见部分线粒体肿胀，粗面内质网排列松散，核糖体减少等现象。
④WesternBlot：与Control组小鼠比较，各组小鼠总Tau蛋白和三个不同位点磷酸化的Tau蛋白含量均有不同程度的升高，与Model组小鼠相比，各给药组小鼠总Tau蛋白和三个不同位点磷酸化的Tau蛋白均有不同程度的减少。
4、实验四结果：
①免疫荧光：与Control组小鼠相比：Model组小鼠海马区Aβ1-42、GFAP、Iba-1、的荧光数量和强度均明显上升，DG区Aβ1-42蛋白的周围分布着大量的GFAP蛋白和Iba-1蛋白；PSD95荧光数量和强度明显减少；Model组小鼠皮层和海马区均可见大量HSP70荧光，各给药组小鼠皮层和海马各个区域的HSP70荧光数量和强度均有不同程度的增强，CA3区和DG区更为明显。与Model组小鼠相比，各个给药组小鼠海马区Aβ1-42蛋白、GFAP蛋白和Iba-1蛋白荧光数量和荧光强度均不同程度的降低，PSD95荧光数量和强度有不同程度增加。
②HSP70和Aβ1-42、Tau荧光共定位：胞内外均可见由HSP70的红色荧光和Aβ1-42的绿色荧光重叠的黄色荧光。由红色荧光的HSP70和绿色荧光的Tau重叠的黄色荧光，几乎都分布在胞外。
③WesternBlot：与Control组相比：Model组小鼠海马组织中的TNF-α、IL-1β、IL-10等脑神经炎症指标和HSF1、HSP70均明显上升；各组小鼠Bcl-2蛋白表达均有不同程度的下调、Bax蛋白和c-Caspase-3蛋白表达均有不同程度的上调、均有不同程度的上调，Model组小鼠尤其明显，而YZ+HL组与Control组的差异不具有统计学意义；Model组小鼠海马组织中的均明显上升。与Model组相比：各给药组小鼠海马组织中的促炎因子TNF-α、IL-1β有明显的下调，IL-10除GGA组的差异具有统计学意义外，其余各给药组与Model组的差异均无统计学意义；各给药组小鼠的Bcl-2蛋白均有上调，Bax蛋白和c-Caspase-3蛋白均有下调；YZ+HL组和GGA组小鼠海马组织中HSF1有明显的上调；其余各给药组与Model组相比，HSP70蛋白的差异均具有高度统计学意义；对YZ+HL和GGA组进行LSD分析，两者在HSF1表达的差异具有统计学意义，HSP70表达的差异无统计学意义。
④高尔基染色：与Control组比较，Model组小鼠脑组织中神经元数量和树突棘均明显减少，镜下可见CA3和DG区的神经元丢失情况最为明显。与Model组相比，各给药组小鼠脑组织中神经元数量、树突棘数量均有不同程度的增多，各给药组海马区神经元树突棘均有明显增加，其差异均具有统计学意义。
结论：
1、虚是AD发生的根本，痰、瘀是AD的病理过程中的重要推动因素，痰瘀化热酿毒进一步加速了AD的发生发展。“虚生痰瘀-痰瘀化热-热结酿毒-毒损脑络”是AD发生发展的四个关键过程。
2、起于病之始的“因虚生热”和现于病之中的“痰瘀化热”导致了“热”可能是推动AD病变发展的重要因素。
3、痰瘀热化酿毒，毒损脑络是AD的最终环节。“痰瘀化热酿毒”的生物学过程可能是错误折叠沉积的Aβ蛋白和异常磷酸化的Tau过度活化了小胶质细胞和星形胶质细胞，诱发了脑神经炎症，促进了SP和NTFs的形成；“毒损脑络”的生物学过程可能是具有神经毒性的寡聚态Aβ蛋白、异常磷酸化的Tau和它们引起的各种致炎因子释放，导致了神经元的凋亡和突触的损伤。“毒”的生物学基础可能是神经损害性错误折叠沉积的Aβ蛋白形成SP和异常磷酸化的Tau形成的NTFs；“热”的生物学基础可能是脑神经炎症反应过程中产生和释放的各种致炎因子。
4、痰瘀同治、清热解毒法可以有效改善AD-痰瘀模型小鼠的学习记忆能力和病理改变，其可能的作用机制是通过调控HSP70介导的神经保护机制，抑制了Aβ的生成和沉积、Tau的异常磷酸化，进而抑制了星形胶质细胞和小胶质细胞的激活，减轻了脑神经炎反应，减少了神经元的凋亡，保护了海马神经元和树突棘，发挥了神经保护作用。
通过理论研究初步提出较为系统的AD病变全过程的病机演变规律，探析由因虚生热和痰瘀化热导致的“热”推动AD病变发展这一重要病机，及AD病理变化的四个关键过程：“虚生痰瘀-痰瘀化热-热结酿毒-毒损脑络”，探讨AD病理进程中的“热”和“毒”的理论内涵，梳理痰瘀同治、清热解毒法防治AD的理论依据。
通过实验研究探索建立稳定可靠的AD-痰瘀互结病证结合动物模型，解析痰瘀同治、清热解毒法对AD-痰瘀互结病证结合动物模型的干预作用及其可能的作用机制，阐明痰、瘀在AD的病理变化过程中存在“化热”这一关键过程，并尝试揭示“痰瘀化热酿毒”“毒损脑络”的生物学过程以及“热”和“毒”可能的生物学基础，初步证实痰瘀同治、清热解毒法可通过调控HSP70介导的神经保护机制发挥改善脑神经炎症、改善海马神经元突触结构和可塑性、抑制神经元凋亡等作用。
方法：
1、理论研究方法：
以《古今图书集成医部全录》、《四库全书》子部、《中华医典》(第5版)为主要工具，综合古今医家之言，系统梳理虚、痰、瘀及痰瘀互结、化热酿毒、毒损脑络这些因素和环节与AD的关联，整理中医学对AD病变全过程的病机演变认识，探析“热”和“毒”的理论内涵，梳理痰瘀同治、清热解毒法防治AD的的理论依据。
2、实验研究方法：
①以3月龄APP/PS1双转基因小鼠作为AD的疾病模型动物，用D12492高脂饮食饲喂，改变其血脂指标，以模拟中医“痰”证的病理状态；用0℃冰水浴处理，改变其血液流变指标，以模拟中医“瘀”证的病理状态；二者结合模拟同时存在“痰”“瘀”的病理状态，分别建立AD-痰、瘀、痰瘀互结病证结合动物模型。通过比较各组小鼠的学习与记忆能力，舌色客观变化，以及血脂、血液流变学、脑神经炎症、AD相关病理变化的指标来评价模型，探索建立稳定可靠的AD-痰、瘀、痰瘀互结病证结合动物模型。
②复制AD-痰瘀互结证病证结合动物模型，分为5个组：不予给药处理的模型组、给予痰瘀同治的益智温胆汤组、给予清热解毒的黄连解毒汤组、同时给予痰瘀同治和清热解毒的益智温胆汤+黄连解毒汤组，以及作用机制对照药物替普瑞酮组，并以同系遗传背景的非转基因C57小鼠作为空白对照组，分别处理40天。Morris水迷宫法检测各组小鼠学习记忆能力；刚果红染色法、甘氨酸镀银染色法、透射电镜法、高尔基染色法等方法分别观察各组小鼠海马区SP、NFTs、神经元超微结构变化、突触和树突棘的改变等；使用免疫荧光标记法，WesternBlot法检测各组小鼠海马组织内相关蛋白的表达和共定位关系，比较各组小鼠的病理改变、脑神经炎症、凋亡、突触、线粒体功能等的变化情况。
结果：
1、实验一结果
①Morris水迷宫：与AD-Model组比较，各组小鼠的平均游泳速度差异无统计学意义。Control组小鼠游泳总路程和上平台潜伏期明显更短，穿越平台次数明显更多，其余各组小鼠的游泳总路程、上平台潜伏期和穿越平台次数差异无统计学意义。
②舌色对比：与AD-Model组小鼠相比，Control组小鼠舌色偏淡红，其余各组小鼠舌色偏暗红。AD-Pbs组小鼠的舌色r值最小。
③血液流变学指标检测：与AD-Model组小鼠相比，Control组小鼠全血黏度和血浆黏度更低。其余各组小鼠的全血黏度和血浆黏度均有不同程度升高。而与AD-Model组小鼠相比，AD-Bss组和AD-Pbs组小鼠的全血黏度和血浆黏度更高。
④血脂指标检测：与AD-Model组小鼠相比，Control组小鼠血脂指标差异无统计学意义。其余各组小鼠的血脂指标均有不同程度升高，与AD-Model组小鼠相比，AD-Ps组和AD-Pbs组小鼠的各项血脂指标更高，但其差异不具有统计学意义。
⑤WesternBlot：与Control组小鼠相比，各组小鼠的海马组织TNF-α、IL-1β和T-Tau均明显升高。与AD-Model组小鼠比较，AD-Pbs组小鼠海马组织中的TNF-α、IL-1β和T-Tau的差异具有统计学意义。
2、实验二结果：
①Morris水迷宫：与Control组比较，各组小鼠游泳总路程和上平台潜伏期明显延长，穿越平台次数明显减少。与Model组比较，各组小鼠平均游泳速度差异无统计学意义，各给药组小鼠游泳总路程和上平台潜伏期均缩短，穿越平台次数有不同程度的增加。
②跳台实验：与Control组比较，各组小鼠潜伏期明显缩短、出错次数增加；与Model组比较，各给药组小鼠潜伏期延长、出错次数减少。
3、实验三结果：
①刚果红染色：Control组小鼠海马区和皮层中几乎没有观察到SP，而Model组小鼠海马区和皮层中散在分布着许多SP，各给药组SP均有不同程度的减少。
②甘氨酸银浸镀：与Control组小鼠相比，Model组小鼠海马区染色明显加深，镜下可见大量被染成黑色条状的NFTs，以CA3区最为明显；各给药组小鼠海马区的NFTs有不同程度减少。
③透射电镜：Control组小鼠海马神经元细胞结构完整，染色质团聚在核内，线粒体丰富，核糖体和粗面内质网均匀散在分布在胞质中。Model组小鼠海马神经元出现细胞死亡现象，镜下可见细胞核塌陷，边界破解甚至消失，染色质固缩或消失，视野内可见若干凋亡小体分布，线粒体数量明显减少，且大部分线粒体出现肿胀甚至破裂，粗面内质网结构松散，仅可见少量零星分布的核糖体。各给药组小鼠海马神经元也存在不同程度的损伤，但细胞核整体形态正常、结构完整，镜下可见部分线粒体肿胀，粗面内质网排列松散，核糖体减少等现象。
④WesternBlot：与Control组小鼠比较，各组小鼠总Tau蛋白和三个不同位点磷酸化的Tau蛋白含量均有不同程度的升高，与Model组小鼠相比，各给药组小鼠总Tau蛋白和三个不同位点磷酸化的Tau蛋白均有不同程度的减少。
4、实验四结果：
①免疫荧光：与Control组小鼠相比：Model组小鼠海马区Aβ1-42、GFAP、Iba-1、的荧光数量和强度均明显上升，DG区Aβ1-42蛋白的周围分布着大量的GFAP蛋白和Iba-1蛋白；PSD95荧光数量和强度明显减少；Model组小鼠皮层和海马区均可见大量HSP70荧光，各给药组小鼠皮层和海马各个区域的HSP70荧光数量和强度均有不同程度的增强，CA3区和DG区更为明显。与Model组小鼠相比，各个给药组小鼠海马区Aβ1-42蛋白、GFAP蛋白和Iba-1蛋白荧光数量和荧光强度均不同程度的降低，PSD95荧光数量和强度有不同程度增加。
②HSP70和Aβ1-42、Tau荧光共定位：胞内外均可见由HSP70的红色荧光和Aβ1-42的绿色荧光重叠的黄色荧光。由红色荧光的HSP70和绿色荧光的Tau重叠的黄色荧光，几乎都分布在胞外。
③WesternBlot：与Control组相比：Model组小鼠海马组织中的TNF-α、IL-1β、IL-10等脑神经炎症指标和HSF1、HSP70均明显上升；各组小鼠Bcl-2蛋白表达均有不同程度的下调、Bax蛋白和c-Caspase-3蛋白表达均有不同程度的上调、均有不同程度的上调，Model组小鼠尤其明显，而YZ+HL组与Control组的差异不具有统计学意义；Model组小鼠海马组织中的均明显上升。与Model组相比：各给药组小鼠海马组织中的促炎因子TNF-α、IL-1β有明显的下调，IL-10除GGA组的差异具有统计学意义外，其余各给药组与Model组的差异均无统计学意义；各给药组小鼠的Bcl-2蛋白均有上调，Bax蛋白和c-Caspase-3蛋白均有下调；YZ+HL组和GGA组小鼠海马组织中HSF1有明显的上调；其余各给药组与Model组相比，HSP70蛋白的差异均具有高度统计学意义；对YZ+HL和GGA组进行LSD分析，两者在HSF1表达的差异具有统计学意义，HSP70表达的差异无统计学意义。
④高尔基染色：与Control组比较，Model组小鼠脑组织中神经元数量和树突棘均明显减少，镜下可见CA3和DG区的神经元丢失情况最为明显。与Model组相比，各给药组小鼠脑组织中神经元数量、树突棘数量均有不同程度的增多，各给药组海马区神经元树突棘均有明显增加，其差异均具有统计学意义。
结论：
1、虚是AD发生的根本，痰、瘀是AD的病理过程中的重要推动因素，痰瘀化热酿毒进一步加速了AD的发生发展。“虚生痰瘀-痰瘀化热-热结酿毒-毒损脑络”是AD发生发展的四个关键过程。
2、起于病之始的“因虚生热”和现于病之中的“痰瘀化热”导致了“热”可能是推动AD病变发展的重要因素。
3、痰瘀热化酿毒，毒损脑络是AD的最终环节。“痰瘀化热酿毒”的生物学过程可能是错误折叠沉积的Aβ蛋白和异常磷酸化的Tau过度活化了小胶质细胞和星形胶质细胞，诱发了脑神经炎症，促进了SP和NTFs的形成；“毒损脑络”的生物学过程可能是具有神经毒性的寡聚态Aβ蛋白、异常磷酸化的Tau和它们引起的各种致炎因子释放，导致了神经元的凋亡和突触的损伤。“毒”的生物学基础可能是神经损害性错误折叠沉积的Aβ蛋白形成SP和异常磷酸化的Tau形成的NTFs；“热”的生物学基础可能是脑神经炎症反应过程中产生和释放的各种致炎因子。
4、痰瘀同治、清热解毒法可以有效改善AD-痰瘀模型小鼠的学习记忆能力和病理改变，其可能的作用机制是通过调控HSP70介导的神经保护机制，抑制了Aβ的生成和沉积、Tau的异常磷酸化，进而抑制了星形胶质细胞和小胶质细胞的激活，减轻了脑神经炎反应，减少了神经元的凋亡，保护了海马神经元和树突棘，发挥了神经保护作用。