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研究背景:恶性肿瘤严重威胁人类健康和生命。化疗是其主要治疗手段之一。肿瘤内药物递送屏障严重降低了药物的肿瘤基质转运效率及血管转运效率,从而阻碍了药物高效渗透到肿瘤细胞,导致药物递送效率低,不能有效杀死肿瘤细胞,反而容易引起肿瘤复发、进展和耐药。肿瘤药物递送障碍包括肿瘤病态血管及肿瘤内致密的细胞外基质。针对不同的肿瘤药物递送障碍陆续出现了相应的多种干预治疗方法,包括针对肿瘤病态血管的血管正常化策略,针对肿瘤内细胞外基质主要成分（如透明质酸）的抑制合成、促进分解策略以及一些机械破碎和热疗方法来破坏肿瘤内致密基质屏障作用等等。虽然不同治疗策略都在动物或临床试验中取得了一定的研究成果,但仍暴露出缺乏靶向性的问题,导致出现一些毒副作用而限制了部分药物的临床应用等问题。因此,如何更好地解决肿瘤内药物递送屏障问题以提升药物递送效率、减少毒副作用,仍是临床医生抗肿瘤治疗需要解决的巨大难题,有待大量的基础研究和临床应用的探究与检验。希望通过这些不断的努力以及新的改进、探索,肿瘤药物递送障碍问题最终能被解决,使得用更低的药物剂量就能达到较好的抗肿瘤治疗效果、毒副作用更低,最终使病人的生存率和生活质量得到显著改善。研究目的:1.合成一种新型高效靶向纳米化疗药物c（RGDyK）-HAase-IONP/DOX,靶向肿瘤并降解其致密基质中大量的透明质酸而解除肿瘤致密基质屏障作用,从根本上提高药物递送效率,以达到更好的抑瘤效果。对其进行一系列表征,并评估新型纳米化疗药物的水溶性、稳定性及酶活性,计算载药量和包封率等。2.评估比较c（RGDyK）-HAase-IONP/DOX在生理和酸性p H条件下的体外药物释放效率情况。3.评价c（RGDyK）-HAase-IONP纳米载体的肿瘤细胞靶向性,评估c（RGDyK）-HAase-IONP/DOX纳米药物及相应纳米载体的细胞毒性作用。4.探讨c（RGDyK）-HAase-IONP的体内靶向性、生物分布及瘤内的递送效果,评价该新型高效靶向纳米化疗药物抗肿瘤治疗效果及体内生物安全性。研究方法:1.首先构建高效靶向纳米药物载体c（RGDyK）-HAase-IONP,再通过物理包埋的方式将疏水性化疗药物DOX装载到IONP两亲性聚合物涂层的疏水空间中,制备出能够解除肿瘤致密基质屏障的高效肿瘤靶向纳米化疗药物c（RGDyK）-HAase-IONP/DOX。应用TEM、DLS、电位分析仪及荧光分光光度计等表征其形态、粒径、电位及吸收和发射光谱。通过浊度法验证c（RGDyK）-HAase-IONP/DOX的酶活性。利用HPLC测定DOX的载药量和包封率。此外,我们还将其分别溶解到生理盐水、水、PBS和含10%FBS的DMEM培养基中,在室温静止存放7天后,测定其流体动力学尺寸及粒径分布,探究其在不同生理性分散介质中的可溶性及稳定性。2.将高效靶向纳米化疗药物c（RGDyK）-HAase-IONP/DOX溶于p H分别为7.4和5.5的PBS缓冲溶液中,并将其转移至透析袋内。再将透析袋沉浸在装有20 m L相应p H的PBS溶液的离心管中,并用37℃恒温摇床轻微摇动。在每个预先设定的时间点,从20 m L PBS溶液中取出0.2 m L溶液待测,并用等量相应PBS补充。通过HPLC测定并计算出每个时间点DOX的累积释放量,并分析研究两组药物释放效率的变化情况,以评估c（RGDyK）-HAase-IONP/DOX在生理性和酸性p H条件下的体外药物释放效率。作为对照,单纯DOX和IONP/DOX的药物释放情况也用上述方法进行了研究。3.为了研究新型纳米载体c（RGDyK）-HAase-IONP的靶向性,我们选用鼠源结肠癌细胞MC38,分别用近红外荧光染料ICG标记的c（RGDyK）-HAase-IONP及ICG标记的IONP进行孵育。为了进一步验证c（RGDyK）对肿瘤细胞的靶向性,我们设置了c（RGDyK）阻断组。通过共聚焦显微镜观察各组细胞靶向性结合情况。在细胞毒性实验的研究中,我们采用在对数生长期、生长状况良好的鼠源结肠癌细胞MC38进行了研究,毒性实验分为四组:单纯DOX组,IONP/DOX组,HAase-IONP/DOX组和c（RGDyK）-HAase-IONP/DOX组。我们分别用0.1、10、100、200、300和900 ng/m L的药物（DOX）浓度进行毒性研究,通过各组不同处理及孵育后,分别加入含10%Alamar Blue的培养基溶液100μL,培养约3小时后,用酶标仪测量590 nm处吸光度值。并计算不同浓度药物作用下细胞存活率。此外,各纳米载体对MC38的细胞毒性实验也用相同的方法进行了研究。4.构建MC38荷瘤小鼠模型。首先,我们对MC38肿瘤组织进行透明质酸抗体染色以表明肿瘤ECM中大量透明质酸的存在,为HAase的引入干预策略提供实验依据。而后,为了进一步确定不同纳米载体在肿瘤内的作用效果及瘤内具体分布情况,将荷瘤小鼠随机分为三组:ICG-IONP组、ICG-HAase-IONP和ICG-c（RGDyK）-HAase-IONP组,分别经尾静脉注射ICG标记的相应纳米载体（IONP的量为400 pmole）100μL。尾静脉注射后24小时在异氟烷麻醉下应用小动物活体成像系统进行体内荧光信号检测,以观察比较三组纳米载体在荷瘤小鼠体内的肿瘤靶向性、瘤内累积和生物分布情况。在瘤内递送效果及定位分析研究中,我们对冷冻的肿瘤组织切片进行HE染色,以观察肿瘤的组织形态,并进行相关分子标记物（CD31、CK19）的免疫荧光染色以便于更直观地分析纳米载体与血管和肿瘤细胞之间的位置关系,并使用荧光共聚焦显微镜与近红外荧光信号共聚焦,以定位不同ICG标记的纳米载体的瘤内分布。我们同样使用MC38荷瘤小鼠模型进行新型高效靶向纳米化疗药物抗肿瘤治疗效果的评估。将荷瘤小鼠随机分为五组:（1）单纯DOX组,（2）IONP/DOX组,（3）HAase-IONP/DOX组,（4）c（RGDyK）-HAase-IONP/DOX组,（5）生理盐水对照组,每组5只。隔天监测肿瘤体积及小鼠体重,并在初次治疗后第16天处死小鼠,取各组小鼠的肿瘤及主要器官进行HE染色、Ki67、cleaved caspase-3及透明质酸抗体的组织学免疫荧光染色及分析,评估各组的抗肿瘤治疗效果及体内生物安全性。研究结果:1.成功构建了能够解除肿瘤致密基质屏障作用的靶向纳米载体c（RGDyK）-HAase-IONP,并成功装载了疏水化疗药物DOX,制备出高效靶向纳米化疗药物c（RGDyK）-HAase-IONP/DOX。c（RGDyK）-HAase-IONP/DOX的水合粒径约为27nm,粒径较均一,Zeta电位约为6.5 m V,在不同生理性溶液中均展示出良好的稳定性,载药量为21.7%。我们也通过浊度法证明了c（RGDyK）-HAase-IONP/DOX的酶活性。2.在体外药物释放实验中我们发现,与单纯DOX相比,c（RGDyK）-HAase-IONP/DOX能够有效地缓释药物,并且在生理和酸性p H条件下展示出不同的药物释放效能。在p H为5.5的酸性条件下,药物释放速率更快,累积药物释放量更高,这将有利于在肿瘤酸性微环境下快速高效地释放药物。3.体外细胞靶向性摄取实验表明,新型高效靶向纳米载体c（RGDyK）-HAase-IONP对MC38肿瘤细胞具有良好的主动靶向作用,从而增加药物向肿瘤细胞的靶向递送,以提升抑瘤疗效、减少毒副作用。在体外细胞毒性实验中,我们证明了本研究中应用的纳米载体剂量对细胞没有毒性作用,具有良好的生物安全性;DOX封装在新型高效靶向纳米载体c（RGDyK）-HAase-IONP中不影响其细胞毒性作用,c（RGDyK）-HAase-IONP/DOX能够有效抑制MC38肿瘤细胞的生长,具有良好的体内抗肿瘤治疗应用前景。4.MC38肿瘤组织切片的透明质酸抗体免疫荧光染色证实了肿瘤细胞外基质中有大量透明质酸存在,这将阻碍抗肿瘤药物高效递送到肿瘤细胞中,同时该实验结果也为本研究中引入HAase解除肿瘤致密屏障作用的策略提供了实验基础的支持。在体内荧光成像中,c（RGDyK）-HAase-IONP展示了良好的肿瘤靶向性,可以更多的在肿瘤部位聚集,并通过与血管染色的共定位,确定了c（RGDyK）-HAase-IONP不仅在肿瘤中高度积累,而且能够有效地渗透到远离血管的深层位置,从而可将药物递送到更多的肿瘤细胞中,有利于药物的全面起效,以改善抗肿瘤治疗效果。在体内疗效评估中,我们从多个角度证明了c（RGDyK）-HAase-IONP/DOX治疗组显著抑制了肿瘤的生长、抗肿瘤治疗效果最佳,并通过组织学实验证明了其能够有效降解肿瘤内致密透明质酸屏障,且具有良好的体内安全性。结论:在本研究中,我们通过c（RGDyK）的修饰提升了IONP的肿瘤靶向性,并引入HAase以降解肿瘤细胞外基质中大量的透明质酸屏障,成功构建了一种新型高效靶向纳米载体c（RGDyK）-HAase-IONP,并装载疏水性化疗药物DOX,获得了能够解除肿瘤致密基质屏障的靶向纳米药物c（RGDyK）-HAase-IONP/DOX。我们通过一系列表征实验证明了c（RGDyK）-HAase-IONP/DOX的成功构建,且展示了良好的水溶性和稳定性。并通过体外、细胞及动物实验研究了其靶向性、瘤内递送情况、抗肿瘤治疗效果及体内生物安全性。该新型高效靶向纳米药物具有良好的肿瘤靶向性,能够有效降解肿瘤内致密透明质酸、破除其药物递送屏障作用,提升肿瘤部位、尤其是远离血管的肿瘤深部的药物递送效果,从而从根本上改善抗肿瘤疗效。