原发性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我国是一种常见的恶性肿瘤。虽然手术治疗明显改善了肝细胞癌患者的预后,但总体上肝细胞癌术后5年生存率为40%左右,其中多结节性肝细胞癌和肝细胞癌术后复发是严重阻碍患者手术远期疗效的两个重要瓶颈。了解多结节性和术后复发性肝细胞癌的生物学特性与治疗模式和预后的关系,可以为临床上更合理的个体化治疗肝细胞癌提供有用的理论依据。多结节性肝细胞癌和术后复发性肝细胞癌克隆起源方式可分为肝内转移(intrahepatic metastasis,IM)和多中心发生(multicentric occurrence,MO)两种情况,前者属于单克隆起源,而后者为多克隆起源。判断肝细胞癌克隆起源对于患者治疗方案选择以及评估预后十分必要。从理论上讲,如果某个多结节性肝细胞癌为MO,那么各个结节的生物学行为与单发病灶的肝细胞癌相同,手术疗效优于肝内转移。但如果多结节病灶为IM,即肝内的多个病灶为癌细胞在肝内的扩散,由于手术难以切除全部癌灶而可能导致手术治疗效果不佳或失败。同样,复发性肝细胞癌的复发病灶既可能是IM,即术后复发的肝细胞癌来自术后肝内残留的病灶,也可能是MO,此类术后再次出现肝细胞的癌变,产生新的肿瘤,即第二次原发癌灶。长期以来临床上缺乏有效的标志物检测肝细胞癌克隆起源。国内外一些学者试图从临床病理学特点和分子生物学特性方面鉴别肝细胞癌的克隆起源,经过多年的尝试,学者们发现DNA倍体分析、p53基因突变差异位点分析、HBV-DNA整合位点分析以及X染色体失活连锁的HUMARA等检测方法虽然各自均具有一定的优势,但是也都有明显的缺欠。目前认为,肝细胞癌的发生发展是一个多因素参与的多阶段、多步骤的演变过程,在这个过程中涉及到的一系列遗传学改变(如癌基因的激活、抑癌基因的失活等)是其发生发展的分子基础。包括肝细胞癌在内的很多肿瘤存在基因或基因组不稳定性或者遗传不稳定性。肝细胞癌中,发生在染色体1p,4q,5q,8p,8q,9p,10q,11p,13q,14q,16q,17p和22q上的杂合性缺失(loss of heterozygosity,LOH)十分常见,提示紧密连锁这些染色体区域上的相关抑癌基因在肝细胞癌的发生和发展中发挥重要的作用。多结节性和复发性肝细胞癌中不同结节之间出现不同LOH模式显示它们由不同的肿瘤克隆组成,提示其多克隆起源和多发灶性发展。从技术上讲,微卫星LOH分析对于DNA含量少的标本,如针吸活检或者肝组织活检均适用,因此有助于在术前了解肿瘤的克隆来源。此外,对于福尔马林固定石蜡包埋的存档肝细胞癌标本,在显微组织切割基础上亦可有效地提取基因组DNA进行LOH检测。研究目的:⑴选择不同染色体上15个微卫星位点对多结节性肝细胞癌和复发性肝细胞癌进行LOH分析,通过比较各肿瘤结节间LOH模式的异同,借此区分肝内转移和多中心发生;⑵建立一组具有较高MO检出率的微卫星位点检测谱;⑶比较研究肝内转移和多中心发生肝细胞癌的临床病理学特点,并进一步探讨复发性肝细胞癌克隆起源不同对预后的影响。研究方法:根据我科前期关于肝细胞癌基因组不稳定以及小肝细胞癌微卫星变异特点的相关研究结果,选择7个高频微卫星LOH位点。此外,另选择8个文献报道的微卫星LOH位点。以手术切除的40例复发性肝细胞癌和30例多结节性肝细胞癌为主要研究对象。首先根据癌结节的组织病理学对其克隆起源进行判断。然后经显微切割技术分别获取肿瘤和癌旁肝组织,经DNA抽提和微卫星PCR-SSCP检测,分析肿瘤微卫星LOH,比较多结节性和复发性肝细胞癌中多个癌结节不同微卫星位点LOH的差异,作为判断肝细胞癌克隆起源的分子依据,并通过毛细管电泳测序验证微卫星PCR-SSCP检测LOH的准确性。结果:判断克隆起源的标准:对同一病例中不同肿瘤结节的15个微卫星位点进行LOH分析,当信息性位点上各肿瘤结节LOH模式均相同,判断为IM;当各肿瘤结节出现不同LOH模式的微卫星位点数目/信息性位点总数大于30%,则判断为MO;而小于30%则为无法判断克隆起源(UD)。30例多结节性肝细胞癌中,15个微卫星位点发生LOH的频率从22.2%到56.9%,平均为36.7%。多结节性肝细胞癌中,33.3%(10/30)和60.0%(18/30)的患者分别诊断为MO以及IM,2例(6.7%)患者无法判断克隆来源,形态学和PCR-SSCP检测结果差异率为23.3%(7/30)。40例复发性肝细胞癌病例中,15个微卫星位点发生LOH的频率从26.8%到46.9%,平均为37.5%。复发性肝细胞癌中,30.0%(12/40)和65%(26/40)的患者分别诊断为MO和IM,2例(5%)患者无法判断克隆来源,形态学和PCR-SSCP检测结果差异率为22.5%(9/40)。从上面2组研究对象中各随机抽取4例配对样本进行毛细管电泳测序,其结果与PCR-SSCP分析LOH的结果一致。70例研究对象中,22例诊断为MO,其中有59.1%(13/22)均检测到D4S402、D4S406位点LOH模式不同,此外D17S831、D16S505、D17S938和D8S277这4个位点LOH模式不同占MO患者总数也均高于30%;而D8S258和D8S520位点则小于10%。剔除D8S258即14个微卫星位点即可将22位MO病例检测出来。将66例明确克隆起源的肝细胞癌分为MO和IM组,比较二组临床病理指标的不同,结果发现二组在肿瘤大小、肿瘤是否侵犯血管、组织学分级和肝脏伴随病变上有统计学差异。在复发性肝细胞癌中,MO和IM组至疾病进展时间分别为(33.75±4.45)月和(14.23±2.54)月,MO组明显长于IM组(P=0.001)。结论:1.选择位于多条染色体(1,4,8,13,16和17)上的15个微卫星位点,应用PCR-SSCP方法对多结节性和复发性肝细胞癌中不同肿瘤结节进行LOH分析,根据癌结节LOH模式的异同,可以在分子生物学水平上判断多结节性肝细胞癌和复发性肝细胞癌的克隆起源。该方法是弥补组织形态学诊断不够准确的理想方法之一。2.联合15个微卫星位点与联合14个位点(除外D8S258)在判断肝细胞癌克隆起源上具有同样的准确率。其中,在多中心发生肝细胞癌中检出D4S402、D4S406、D17S831、D16S505、D17S938和D8S277位点上存在不同LOH模式的比例均超过30%,提示该6个位点更为敏感和特异,可以作为鉴别多中心发生肝细胞癌的首选位点。3.对石蜡切片进行显微切割获取肿瘤组织DNA,结合PCR-SSCP技术进行LOH分析简单、经济、可行,且电泳条带和毛细管电泳测序结果基本一致。4.虽然组织学检查不能作为判断肝细胞癌克隆起源的主要依据,但在肝硬化基础上,肿瘤体积较小,肿瘤无血管侵犯,组织学分化好、复发间期时间长与肝细胞癌多中心发生密切相关。将临床病理学指标、组织形态学以及微卫星LOH检测相结合可以对多结节性和复发性肝细胞癌的克隆起源做出比较准确的判断。5.通过对复发性肝细胞癌生存分析发现,多中心发生的复发性肝细胞癌在第一次手术切除后至下一次肝细胞癌复发的间隔明显延长,预后较好。