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本文首次通过在价廉、易得的偶氮染料上引入碱性磷酸酶（AKPEC.3.1.3.1）抑制剂基团，制备出八种用于亲和纯化小牛肠碱性磷酸酶的拟生物染料亲和配基，用MS、IR及1H-NMR等手段鉴定它们的结构。分别测试它们对小牛肠碱性磷酸酶的纯化效果，发现配基V对小牛肠碱性磷酸酶的吸附选择性最好，进一步对其用于小牛肠碱性磷酸酶亲和纯化的层析条件进行了优化。用配基V首次纯化了文献尚未见报道的海藻孔石莼碱性磷酸酶，同时对孔石莼碱性磷酸酶的性质进行了研究。首次利用EPR、VIS、XRS谱学方法研究了各种金属离子对小牛肠碱性磷酸酶活性影响的微观机制。最后利用邹氏酶活性不可逆抑制动力学研究了EDTA对小牛肠及海藻孔石莼碱性磷酸酶的不可逆抑制动力学，揭示这两种来源不同的酶在结构上的差异。得到了以下一些有意义的结果： 1．在八种合成的配基中，配基V对小牛肠AKP有高的亲和能力，其性能优于国际通用的Cibacron Blue F3GA。 2．配基V在琼脂糖凝胶上偶联的最佳反应条件是偶联反应的最佳初始配基浓度1.0％，最佳反应温度和时间分别为60℃和6小时，配基V在凝胶上的密度为4.55mg/g湿胶时层析介质的选择性最好，用0.1MNaCl和30mM Na2HPO4阶段洗脱吸附在配基V上的小牛肠AKP，可获得比活为990U/mg，回收率为89％的纯化AKP，已达到了国外商品酶的纯度。 3．孔石莼碱性磷酸酶由四个相同的亚基构成，分子量为76kD，亚基分子量为19kD，酶催化的最适pH为9.9，最适温度为37℃，米氏常数Km和最大反应速度Vmax分别为0.950mM和5.00μM/min。镁离子对孔石莼碱性磷酸酶的酶活力基本无影响，但钴离子、镍离子和铜离子对酶活力有明显的抑制作用。2.5mM 的二硫苏糖醇（DTT）即能使该酶完全失活，表明该碱性磷酸酶酶活力的保持对分子中二硫键有完全的依赖性。N-琥珀亚酰胺（NBS）对该酶活力有部分抑制作用，表明酶活与色氨酸残基有关。 4．酶活测试表明过渡金属离子Ni2+、Co2+、Cu2+及Zn2+对小牛肠AKP活性具有抑制作用，其中一定浓度的Zn2+可使酶活完全丧失。重金属离摘要 大连理工大学博士学位论文子 Hg卜，Ag“对 AKP活性也具有强的抑制作用，可使酶活丧失。当 Ag”和Hgk浓度达到500 V M时，酶活残存分别为4．2％和3．19％。EPR、VIS及 XRS荧光光谱的结果表明，Cu‘”、C。‘”之所以抑制 AKP的活性是由于CU’”、C。‘“与＊＊P酶发生了直接相互作用部分取代了酶活性中心的锌离子，形成了 CU（11）－AKP和 CO（11）·AKP酶衍生物。而 XRS荧光光谱证实 Zn》使 AKP酶活性丧失的原因是因为锌离于取代了酶中镁离子，表明镁离子对保持AKP的活性是重要的，这一实验事实文献未见报‘道。加入的＊“同时取代了 AKP活性中心的锌离子、镁离子，导致 AKP酶活丧失。 5．外加的镁离子对AKP的活性也有抑制作用。这可能是由于镁离子部分取代酶活性中心锌离子的原因，因而我们有理由认为小牛肠AKP的活性保持依赖于锌离子与镁离子的协同作用。 6．EDTA 对孔石药及小牛肠碱性磷酸酶的不可逆抑制尽管都是络合型的不可逆抑制，但有不同之处。这可能是由于小牛肠碱性磷酸酶活性位点的金属离子相对于孔石菇碱性磷酸酶的活性伍点来说突出在酶大分子的表面，EDTA容易与之发生络合作用，从而快速对小牛肠AKP产生抑制作用。