弓形虫(Toxoplasma gondii)是世界性分布的专性细胞内寄生原虫,可感染人类和几乎各类哺乳动物,可导致弓形虫病。该病呈世界性分布,是一种严重危害人类健康的人兽共患寄生虫病。根据世界卫生组织2002年统计,估计有6亿多人口受威胁,近3亿弓形虫感染者。人类弓形虫病是胎儿先天宫内感染,或因后天摄入经猫粪排出的卵囊污染的食物或含有包囊的肉而获得感染。先天性弓形虫病较为严重,常导致严重孕妇流产、死胎或畸形等,先天婴儿感染常导致严重疾病及死亡。成人弓形虫感染多无明显临床表现而呈无症状带虫状态,但在免疫抑制或免疫缺陷病人中(如骨髓和器官移植的受者、恶性肿瘤患者、AIDS病人和长期使用免疫抑制剂患者等),是导致病人死亡的病原之一。此外,弓形虫也可引起禽畜疾病,给畜牧业,尤其猪、牛饲养业带来了严重经济损失。因此,研制安全、有效的疫苗以控制先天性弓形虫感染;建立简便、快速、敏感的弓形虫感染早期诊断方法是有效控制弓形虫病的两个很重要的措施。本研究构建并体外表达了弓形虫真核表达质粒pcDNA3.1-GRA4(pGRA4),研究该基因体外表达产物的抗原性及其在小鼠肌肉组织中的表达,检测弓形虫真核表达质粒pGRA4免疫小鼠所诱导的体液和细胞免疫应答;采用脱水-再水化法构建脂质体并包裹pGRA4免疫小鼠,探讨脂质体包裹真核表达质粒pGRA4免疫小鼠对弓形虫感染的保护效果,探索增强DNA免疫的新途径,为弓形虫病的免疫预防提供理论及实践依据。结果显示,成功构建弓形虫真核重组表达质粒pGRA4,表达产物经SDS-PAGE和Western blot显示分子量为40KDa,与预计一致;免疫小鼠后,脂质体包裹pGRA4组和裸露pGRA4组的IgG抗体水平较对照组均明显升高(P＜0.01),但该两组之间无显著差异(P＞0.05)。抗体亚型分析显示,IgG2a明显大于IgG1;细胞因子实验结果表明,各组均未检测到IL-4的表达,IL-2和IFN-γ表达显著升高,这些说明脂质体包裹pGRA4免疫和裸露pGRA4免疫小鼠引起Th1类型的免疫反应。弓形虫弱毒ME49株攻击感染试验结果显示,脂质体pGRA4真核表达质粒组小鼠获得了更高的保护率,存活鼠脑组织包囊数目显著减少(p＜0.01);弓形虫强毒RH株攻击感染结果表明,脂质体包裹pGRA4免疫组小鼠能有效延长死亡时间(p＜0.05)。因此,脂质体包裹弓形虫pGRA4真核表达质粒的方法,可增强小鼠对弓形虫感染的免疫保护。同时本研究还建立了双抗体夹心一步法检测弓形虫循环抗原(CAg)以早期诊断弓形虫感染。为考核该检测方法的敏感性和特异性,在实验室检测的基础上,进行了临床考核试验,检测了5428份人血清,548份人脑脊液和2份人乳汁样本。实验室检测结果,敏感性100%,特异性100%,假阳性率0%,假阴性率0%,CV值;与其他寄生虫进行交叉试验,发现与原虫(疟原虫,隐孢子虫)、吸虫(日本血吸虫、肺吸虫)及线虫(马来丝虫、蛔虫、旋毛虫、十二指肠钩虫)等均无交叉反应;检测阈值为31.2 ng/mL。临床应用考核结果显示,脑瘫病人的CAg阳性率为2.11%,而无神经性症状患者和孕妇的阳性率分别为0.22%和0.71%,差异显著(p＜0.05);脑瘫患者的脑脊液检测阳性率则高达10.5 8%;随访结果显示,CAg的检出与临床症状的发病符合一致。肉类加工工人的阳性率显著高于献血员(p＜0.01)。该快速ELISA法可以作为弓形虫感染急性期和活动期的重要辅助诊断方法,用以早期诊断弓形虫病。