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第一部分人牙周膜干细胞的体外分离培养与鉴定目的:体外分离、培养并纯化人牙周膜干细胞(human periodontal ligament cells,hPDLSCs),通过流式细胞术检测其细胞表面抗原标记物,成骨成脂诱导实验进行多向潜能分化鉴定对其进行初步鉴定,为后续实验研究奠定基础。方法:收集西南医科大学附属口腔医院口腔颌面外科门诊因正畸治疗需要拔除的牙体牙周健康的前磨牙,采用消化组织块法联合有限稀释克隆法进行原代培养并纯化得到hPDLSCs。取纯化后的P3代hPDLSCs进行后续实验,采用CCK8法描绘其正常生长曲线,流式细胞术检测其细胞表面抗原标记物STRO-1、CD146、CD90、CD31的表达;成骨和成脂诱导21天后分别行茜素红染色和油红O染色,光镜下观察矿化结节和脂滴形成情况。结果:原代培养以及有限稀释克隆法培养后所得细胞形态呈长梭形,细胞贴壁呈旋涡状排列生长。生长曲线呈近似“S”型,存在干细胞生长典型的停滞期、对数生长期和平台期;细胞表面抗原标记分子Stro-1、CD146、CD90、CD31 阳性表达率分别为 12.46%、99.15%、99.55%、0.49%,在特定的诱导环境下可形成矿化结节和脂滴。结论:通过酶消化组织块法联合有限稀释克隆法可成功分离培养获得纯化的hPDLSCs。干细胞为中胚层间充质来源,无造血细胞、单核细胞及巨核细胞的污染和混杂。同时还具有较强的自我增殖能力,且在特定的的诱导环境下具有成骨分化和成脂分化的多向分化潜能。第二部分雌激素介导下Wnt/β-catenin信号通路调控人牙周膜干细胞成骨分化目的:探讨雌激素通过Wnt/β-catenin信号通路对hPDLSCs骨向分化过程的调控作用。方法:取第一部分实验所得P3代hPDLSCs,设计实验分组:对照组(Control组):加入单纯成骨诱导液培养;雌激素组(E2组):加入含有浓度为10-7mol/L雌激素的成骨诱导液培养;Wnt3a组:加入含有浓度为l00ng/ml Wnt3a的成骨诱导液培养。各组在成骨诱导7天后采用qPCR和Western blot分别从基因水平和蛋白水平检测各组Wnt/β-catenin信号通路相关分子β-catenin、GSK-3β、P-GSK-3[β、CyclinDl以及成骨相关分子ALP、Runx2、OCN的表达水平变化。各组在成骨诱导1、3、5、7天时分别进行ALP活性检测;结果:各组成骨诱导7天后qPCR和Western blot结果显示:雌激素组和Wnt3a组中β-catenin、P-GSK-3β、CyclinD]的表达水平均高于对照组(P<0.05),而GSK-3β表达水平均低于对照组(P<0.05),同时两实验组间Wnt/β-catenin信号通路相关因子(β-catenin、P-GSK-3β、CyclinD1、GSK-3β)表达水平差异无统计学意义(P>0.05);雌激素组和Wnt3a组的成骨早中晚期标志物ALP、Runx2、OCN表达水平均高于对照组(P<0.05),但两实验组间成骨早中晚期标记物表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。ALP活性检测结果显示各组ALP表达水平随时间推移均呈上升趋势,同时雌激素组和Wnt3a组各作用时间点ALP的表达量均明显高于对照组(P<0.05),而雌激素组和Wnt3a组表达水平差异无统计学意义(P<0.05)。结论:雌激素及外源性Wnt3a蛋白可活化hPDLSCs中的Wnt/β-catenin信号通路,从而促进hPDLSCs成骨分化。且雌激素的促hPDLSCs成骨作用可能与Wnt/β-catenin信号通路被激活有关,但雌激素作用于Wnt/β-catenin信号通路的作用位点尚有待于进一步研究。