第一部分炎性因子IL-17在鼠巨细胞病毒致病机制中的作用[目的]1)建立鼠巨细胞病毒(Murine cytomegalovirus,MCMV)播散性感染动物模型,整体水平观察炎性因子IL-17在肝脏及唾液腺组织中的表达情况,探讨其在MCMV致病过程中发挥的作用；2)应用IL-17抗体中和MCMV播散性感染模型小鼠体内的炎性因子IL-17,进一步研究IL-17在MCMV免疫致病机制中的地位。[方法]1.建立MCMV全身播散性感染模型：选择4.5周龄的雌性BALB/c小鼠,随机分为两组：MCMV感染组与模拟感染对照组。在MCMV感染后3天、7天、14天和28天各组随机选取4只小鼠,给予乙醚麻醉,摘除眼球取血后颈椎脱臼处死,分离血清,无菌收取唾液腺及肝脏组织,部分经4%多聚甲醛固定后石蜡包埋,部分组织置于-70℃冰箱保存。2.病毒滴度测定：取胎鼠胚肺成纤维细胞作为培养细胞,采用标准蚀斑试验检测病毒感染后不同时间点唾液腺及肝脏组织内的感染性病毒滴度。3.组织内IL-17及IL-17R mRNA的表达：用Trizol法提取唾液腺及肝脏组织总RNA,检测RNA纯度将其逆转录为cDNA；采用RT-PCR法检测IL-17及IL-17R mRNA在唾液腺及肝脏组织中的表达水平。每份样本同时检测目的基因和内参GAPDH基因。4.组织内IL-17蛋白表达：制备组织石蜡切片,采用免疫组织化学技术检测唾液腺及肝脏组织中IL-17的表达水平与分布特征。5.组织病理改变：石蜡包埋唾液腺及肝脏组织切片后行苏木紫-伊红染色,评估唾液腺及肝脏组织的病理性损伤。6.血清ALT水平：用罗氏生化分析仪检测血清ALT水平。7.IL-17抗体阻断研究：首先建立MCMV全身播散性感染模型,再腹腔注射IL-17抗体以中和体内表达的IL-17(IL-17阻断组),同时设立正常对照组、MCMV感染对照组和同型抗体对照组,每组小鼠4只。在病毒感染后第7天,各组小鼠给予乙醚麻醉,摘除眼球取血后颈椎脱臼处死,分离血清,无菌收取唾液腺及肝脏组织,部分经4%多聚甲醛固定后石蜡包埋,部分唾液腺及肝脏组织置-70℃冰箱保存。用Western-blot法检测唾液腺及肝脏组织中IL-17蛋白表达水平；采用标准蚀斑试验检测组织中MCMV感染性病毒滴度；用RT-PCR法测定组织中IL-17、IL-17R, IFN-y和IL-10基因转录(mRNA)水平；用HE染色法评估肝脏及唾液腺组织的病理性损伤程度；用罗氏生化分析仪检测血清ALT水平。[结果]1.组织内感染性病毒滴度：唾液腺组织中病毒滴度明显高于肝脏组织,在病毒感染后第7天明显升高,并在14天达到峰值,随后病毒滴度逐渐减低；而肝脏组织中病毒滴度在感染后第3天升高,第7天病毒滴度明显降低,在感染后第14天病毒滴度已低于标准蚀斑试验法的检测水平,无法形成病毒感染性蚀斑。2.组织病理性损伤：①唾液腺组织：在MCMV感染后第7天,唾液腺组织内炎性细胞浸润大量出现；在病毒感染后第14天,炎性细胞浸润更加明显,炎性灶逐渐扩大,并与邻近炎性灶相互融合；在病毒感染后28天病理性损伤逐渐减轻,但是仍可见炎性细胞浸润；②肝组织：MCMV感染组小鼠肝组织在病毒感染后第3天可见肝细胞气球样变性,嗜酸性变明显,门管区可见炎性细胞浸润,肝细胞点状坏死明显；感染后第7天病变达顶峰,肝细胞嗜酸性变,点灶状坏死明显,坏死区有少量炎性细胞浸润,门管区可见大量炎性细胞浸润；随后病变逐渐缓慢减轻,炎性灶缩小。3.血清ALT水平：MCMV感染组小鼠血清ALT水平明显高于正常对照组[(144±11) vs(49.6±5), p<0.05]。4.组织内IL-17和IL-17R mRNA表达：①唾液腺组织：MCMV感染组在感染后各时间点的IL-17mRNA表达均高于正常对照组,在MCMV感染后逐渐升高,并在感染后14天明显高于模拟感染对照组,差异具有统计学意义[(0.4103±0.0636) vs(0.245±0.027),p<0.05],IL-17在唾液腺组织中的表达量与唾液腺组织的病理性损伤明显相关(R=0.616,p<0.05)；IL-17R表达在MCMV感染后呈现逐渐上升趋势,并且在感染后第14天明显高于模拟感染对照组,差异具有统计学意义[(0.345±0.012)vs(0.17±0.023),p<0.05],其高表达与唾液腺组织病理性损伤显著相关(R=0.751,p<0.05)。②肝脏组织：MCMV感染后,肝组织中IL-17mRNA表达逐渐升高,于感染后7天达峰值[(0.67±0.104)vs(0.287±0.046),p<0.05],14天后缓慢下降,其表达量与肝脏组织损伤显著相关(R=0.773,p<0.05)；模拟感染组IL-17R在肝脏组织的表达相对稳定,而MCMV感染组IL-17R表达在各时间点均高于模拟感染对照组,感染后呈逐渐上升趋势,在第7天显著升高,差异有统计学意义[(0.7035±0.0901)vs(0.442±0.112),p<0.05)],随后表达趋于稳定,其表达量与肝组织损伤明显相关(R=0.712,p<0.05)。5.组织内IL-17蛋白表达：MCMV感染组唾液腺组织中IL-17蛋白表达在感染后逐渐升高并在14天达到高峰,随后逐渐降低。IL-17阳性细胞主要分布在腺管周围及炎性细胞浸润密集部位；感染组肝脏组织在感染后3天IL-17表达量明显高于模拟感染组,第7天阳性细胞数增加,随后降低,细胞主要分布于汇管区及肝小叶炎性细胞密集部位。6.IL-17抗体阻断实验：①病毒滴度：与感染对照组及同型抗体对照组相比,IL-17抗体阻断组在MCMV感染后第7天肝脏组织病毒滴度显著降低(p<0.05),而唾液腺中病毒滴度与MCMV感染对照组及同型抗体对照组比较无明显差异(p>0.05)；②组织内IL-17蛋白表达：IL-17抗体阻断组肝脏组织IL-17表达较MCMV感染组及同型抗体对照组比较明显下降(p<0.05),而唾液腺组织IL-17表达量与MCMV感染组及同型抗体对照组相比差异无统计学意义,说明腹腔注射IL-17抗体未能有效中和唾液腺组织中IL-17；③组织病理改变：在病毒感染后第7天,IL-17抗体阻断组肝组织病理性损伤程度明显低于MCMV染对照组及同型抗体对照组；而唾液腺组织病理改变与MCMV感染对照组及同型抗体对照组比较无明显差别。④肝脏组织内IL-17、IL-17R、IFN-y和IL-10基因转录(mRNA)水平：与同型抗体对照组及MCMV感染对照组相比,IL-17抗体阻断组的IFN-γ[(0.56±0.06) vs(0.55±0.13)vs(0.96±0.2),p<0.05]与IL-10[(0.55±0.073)vs(0.51±0.07)vs(0.903±0.18),p<0.05]的表达明显增加；IL-17表达明显降低[(0.77±0.15)vs(0.80±0.14)vs(0.44±0.07),p<0.05]；而IL-17R表达无明显差异[(0.81±0.16)vs(0.89±0.38)vs(0.87±0.23),p>0.05]；⑤血清ALT水平：与MCMV感染对照组及同型抗体对照组相比较,IL-17抗体阻断组的ALT水平显著降低[(146±15)vs(102±11)vs(37±12),p<0.05]。[结论]1.MCMV感染组织内IL-17/IL-17R高表达与组织病理性损伤严重程度密切相关；阻断肝组织IL-17表达可有效减轻肝组织病理损伤和促进肝功能恢复；2.感染早期肝组织内IL-17相关免疫反应有利于肝脏内病毒的清除；3.腹腔注射IL-17抗体可有效阻断肝组织中IL-17表达,却不能中和唾液腺组织中IL-17表达；4.唾液腺内IL-17受体低表达与IL-17和IL-17受体表达高峰延迟等局部免疫特征可能与唾液腺内病毒逃避免疫清除机制有关；5.阻断IL-17表达后,肝组织IFN-y及IL-10表达增加,提示三者可相互调节而发挥不同功能。IFN-γ及IL-10高表达可加速肝组织内病毒的清除和减轻炎症损伤。第二部分MCMV启动Caspase-1信号通路对适应性免疫应答的影响[目的]1.建立MCMV播散型感染动物模型,在整体水平观察Caspase-1信号通路启动情况,初步探讨其在MCMV致病过程中的作用；2.研究Caspase-1信号通路对适应性免疫应答Th17细胞的影响[方法]1.建立MCMV全身播散型感染动物模型：32只4.5周龄雌性BALB/c、鼠被随机分为两组：MCMV病毒感染组与模拟感染对照组。在MCMV感染后3天、7天、14天和28天各组随机选取4只小鼠乙醚麻醉摘除眼球取血后颈椎脱臼处死,分离血清,无菌收取脾脏组织,部分经4%多聚甲醛固定后石蜡包埋,部分组织置于-70℃冰箱保存；2.标准蚀斑试实验检测脾脏组织中感染性病毒滴度；3.Western blot检测脾脏组织中Caspase-1表达强度；4.免疫组化法检测脾组织中IL-1β和IL-18表达状况；5.流式细胞技术检测脾脏组织中Th17细胞数量；6.HE染色法评估脾脏的病理性损伤程度。[结果]1.MCMV感染后,脾脏组织中病毒滴度在感染后第3天已经开始升高,第7天病毒滴度逐渐降低,第14天时用标准空斑实验已经检测不到病毒；2.与模拟感染对照组比较,MCMV感染组在感染后第3天脾组织中Caspase-1[(1.483±0.420) vs (0.176±0.045),p<0.05]表达明显升高后逐渐下降；3.脾脏组织中IL-1p和IL-18表达呈进行性升高,于感染后7天达峰值,14天减少,28天基本接近正常；4.巨细胞病毒感染后,脾脏的Thl7细胞逐渐增多,并在感染后第14天达高峰[(1.14±0.09) vs (0.19±0.04),p<0.05],明显高于模拟感染对照组；5.脾脏组织病理评估：MCMV感染后第3天,脾脏组织病理损害不明显,第7天时白髓淋巴细胞明显增生,并出现较多中性粒细胞与单核细胞；第14天病变逐渐加重,可见大量巨噬细胞、出血坏死及纤维条索增生；第28天时病理损伤明显减轻。[结论]巨细胞病毒感染可使脾脏Caspase-1表达增加,其下游促炎因子IL-1β和IL-18合成和释放增多,进而促进Th17细胞适应性免疫应答反应,在清除病毒的同时也造成了组织免疫病理性损伤。