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单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是一种兼性胞内寄生的革兰氏阳性菌。LM主要通过消化道引起动物和人的感染,是一种重要的人畜共患病原菌,在临床主要引起人和动物的脑膜炎、败血症及流产等,对畜牧业和人类生命健康造成巨大的威胁,被WHO列为四大食源性致病菌之一。在LM感染宿主的过程中需要众多的毒力因子参与,这些毒力因子的编码基因主要集中在LM致病岛1(LIPI-1)和致病岛2(LIPI-2)2个区域中,其中LIPI-1含有6个基因,依次为prfA、plcA、hly、mpl、actA、plcB;LIP-2又称为内化素小岛,主要编码一些小分子的内化素。近年来的研究发现,LM非编码ncRNA在调控其生长、基因表达、糖代谢、金属离子转运、生物膜形成、胞内寄生及环境应激过程中也扮演了重要的角色,其调控模式已经成为LM调控网络中的最重要作用方式之一。根据ncRNAs的调控机制,LM ncRNAs可以分为3种:顺式作用RNA(Cis-acting RNAs,如核糖开关)、反义RNA(Anti-Sense RNAs,asRNAs)和反式编码的小RNA(Trans-encoded small RNAs,sRNAs)。rli87基因属于sRNA,然而目前有关rli87基因的生物学功能尚不清楚。本研究应用同源重组技术构建rli87基因缺失株LM-?rli87,研究了ncRNA rli87缺失对LM生长特性的影响,探讨了rli87在LM环境应激能力和致病性的调控作用。主要研究内容及结果如下:1、单核细胞增生李斯特菌Rli87基因缺失株的构建、鉴定及其生长特性研究根据Gen Bank登录的LMEGD-e基因组序列(登录号:AL591824),用DNAMAN软件进行同源性分析,选择保守区域,用Primer 5.0软件设计扩增上、下游同源臂引物。利用PCR技分别扩增rli87基因上、下游同源臂,然后运用SOE-PCR技术融合上、下游同源臂,获得rli87基因缺失片段。将pMD19-T-△rli87和pKSV7质粒进行双酶切,将rli87基因缺失片段插入到穿梭载体PKSV7上,构建重组穿梭质粒pKSV7-△rli87。用电转化的方法将pKSV7-△rli87电转化到LM EGD-e中,对阳性转化子在氯霉素与42℃条件下传代培养10代,获得具有氯霉素抗性的单交换株;然后在无氯霉素42℃条件下传代培养15代,得到只能扩增出一条584bp的目的片段无氯霉素抗性的双交换基因重组缺失株LM-△rli87。在无氯霉素压力37℃条件下传达培养20代,经PCR检测,结果证实LM-△rli87缺失株具有良好的遗传稳定性。在37℃条件下培养LM EGD-e和LM-△rli87菌株,两者生长差异不显著(p>0.05),该结果证实rli87基因缺失对37℃生长特性没有影响。2、Rli87基因缺失对单核细胞增生李斯特菌环境应激的影响将LM EGD-e强毒株和构建的LM-△rli87缺失株于相同条件下培养后,分别测试在不同温度、pH值、高渗透压及氧化环境压力条件下应急反应,并对应激相关基因的表达量进行检测。选取低温30℃和高温42℃,测定相同培养条件下不同时间点的OD600nm值,并绘制不同温度条件下的生长曲线。结果在不用温度条件下,LM-△rli87生长速度明显高于LMEGD-e(p<0.05)。在不同pH值生长条件下,当pH=9时两株菌生长差异显著(P<0.05);在2%H2O2氧化环境中出现生长停滞,活菌量随着时间的变化呈下降趋势,但LM-△rli87活菌量始终低于LM EGD-e(P<0.05);在pH=9时,与LM EGD-e菌株相比,LM-△rli87缺失株rsbV、rsbW、hpt、clpP、ctsR 5个应激相关基因的表达量均上升,表明在碱性环境中rli87对这5个应激相关基因具有调节作用。3、Rli87基因缺失对单核细胞增生李斯特菌致病力的影响将LM EGD-e与构建的rli87基因缺失株分别感染巨噬细胞RAW264.7和BALB/C小鼠,测其胞内细菌计数、细胞粘附率的计算以及存活小鼠的统计,通过Real-time RT-PCR毒力基因表达量检测的方法检测五个毒力相关因子的表达量,并通过溶血试验分析缺失株与野毒株的致病性差异。结果显示,与LM EGD-e相比,LM-△rli87缺失株的粘附率和侵袭力均下降;肝、脾载菌量减少;缺失株的半数致死量较野毒株升高了103个数量级;毒力基因hly和PrfA的转录水平显著下降。溶血试验测定结果发现,与强毒株LM EGD-e相比,LM-△rli87的溶血能力明显降低。由于LM的溶血能力由LIPI-I上的hly基因编码,结果提示rli87基因对hly基因的表达具有调控作用。本研究通过SOE-PCR技术与同源重组的方法成功构建了rli87基因缺失株,并研究了Rli87基因缺失对LM环境应激及致病力的影响。与LM EGD-e相比,Rli87基因缺失株的环境应激能力下降,致病性减弱,由此表明,rli87基因对细菌毒力具有一定的调控作用,为揭示rli87调控LM毒力的分子机制奠定了前期基础。