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猪是人异种器官移植理想的器官来源。体细胞核移植为人们生产不引起免疫排斥以及无内源性病毒的猪提供了可能。本研究系统地研究了猪体细胞克隆相关技术环节,旨在搭建一个能有效生产猪克隆胚的平台。主要内容如下: 利用组织块培养法建立了中国实验用小型猪9个40d胎儿成纤维细胞系和1个成体成纤维细胞系。利用血清饥饿以及接触抑制对细胞进行细胞周期同期化处理,发现细胞同期到G0/G1期的效率相同,而且在处理2d之后,G0/G1期细胞比例不再有显著增加。结果表明胎儿成纤维细胞对血清饥饿以及接触抑制的反应相当,同期处理2d即可为核移植提供足够的供体细胞。 比较了不同培养基,氧分压以及添加胰岛素和LIF对猪卵母细胞体外成熟,成熟后孤雌激活发育的影响,首次尝试将一种新的胚胎培养基PZM-3用于猪卵母细胞体外成熟,还探索了猪体外成熟卵母细胞孤雌激活方案。结果如下:NCSU-23中,卵母细胞核成熟明显优于在TCM199中成熟的效果(p<0.05);1.4kv,100μs,1DC电激活后,卵母细胞死亡率明显高于2.0kv/cm,30μs,1DC和2.0kv/cm,60μs,1DC处理组。但激活后三组间胚胎卵裂率(分别为:72.6%vs.85.9%,73.2%)和囊胚率(分别为:32.1%vs.49.4%,39.0%)相似;化学激活后,胚胎卵裂以及囊胚率都明显不如电激活处理(卵裂率14.4%vs.72.8%;囊胚率3.3%vs.31.5%);以NCSU-23为基础培养基,高氧核成熟显著优于低氧;以改进的PZM-3成熟卵母细胞,核成熟上仍然是高氧优于低氧。若不考虑气相影响,PZM-3的成熟效果明显不如NCSU-23;添加5μg/ml胰岛素后卵母细胞成熟效果显著提高,但是成熟后激活发育没有显著改善。而添加1000 IU/ml LIF卵母细胞核成熟率不但没有明显提高,反而孤雌激活后囊胚率急剧下降,尽管卵裂率以及囊胚细胞总数都没有明显改变。上述结果表明①NCSU23是猪卵母细胞比较理想的培养基,其成熟卵在2.0kv/cm,30μs,1DC或者2.0kv/cm,60μs,1DC电击参数激活下发育比较好;②高氧对卵母细胞核成熟有利,但附植前孤雌胚胎发育具有培养基依赖性;③添加Insulin可以改善卵母细胞核成熟,而添加LIF对卵细胞质成熟有害;④PZM-3如果应用于卵母细胞体外成熟还需要进一步优化。 比较了IVF,PA以及SCNT胚胎的发育率和囊胚质量。三者发育率相似(囊胚率分别为:11.0%,22.6%和16.9%),但是在囊胚质量即ICM/总细胞数比例上,IVF和SCNT胚优于PA胚。比较了PZM-3和NCSU-23培养对孤雌激活胚以及克隆胚发育的影响。对PA胚来讲,PZM-3明显好于NCSU-23(囊胚率35.4%vs.22.6%,p<0.05);而对SCNT胚,PZM-3明显不利于卵裂,但对囊胚发育影响不大(21.1%vs.26.6%,p>0.05)。在NCSU-23+4 mg/ml BSA中添加5μg/ml胰岛素对胚胎发育没有明显促进作用,而添加1000 IU/ml LIF也没发现有损害早期发育的情况。上述结果表明,对孤雌胚或者体外受精胚理想的培养基,当用于克隆胚胎培养时却不一定是最佳的选择;孤雌胚胎在体内发育能力差,可能和ICM/总细胞数很低有关。添加5μg/ml Insulin或者1000IU/ml LIF对孤雌激活胚胎早期发育没有显著影响。 利用脂质体转染技术建立了转GFP的猪胎儿成纤维细胞系,尝试了生产转GFP胚胎的可能性,同时系统研究了供体细胞转染与否、传代次数、准备方式、细胞周期同期化、细胞年龄、细胞形态以及细胞性别等对克隆胚胎早期发育的影响。结果如下:用转GFP的细胞获得克隆胚胎