论文部分内容阅读
选育作物的雄性不育系是杂种优势利用的重要环节。1990年以后,基因工程雄性不育发展非常迅速,许多植物基因表达调控系统已经被建立。本论文采用热激启动子和铜诱导系统控制位点专一性重组酶CRE的表达,通过删除花药特异性启动子(水稻的Osg6B启动子)与RNA酶基因(Barnase基因)之间的阻断序列,从而控制基因工程雄性不育的产生,探索建立可诱导的、集不育系和保持系于一身的植物基因工程雄性不育系统。 1.从大豆中克隆热激蛋白启动子Gmhsp17.5C(Genbank Number AF544399),并以Gus基因为报告基因转化烟草,组织化学染色和荧光定量测定结果显示,经过连续两次热激处理(42℃ 2h)后,在转基因植株的叶和茎组织化学染色显蓝色,诱导后荧光强度是诱导前荧光强度的5倍左右。其次,我们构建的载体系统通过热激诱导表达的CRE重组酶删除靶载体上的两侧带有loxp位点的Gus基因片段(CaMV35S-Gus)。实验结果表明,在转基因烟草中热诱导的基因删除效率可达41%。 2.利用已经建立的热激诱导定位重组系统调控RNA酶基因(Barnase基因)在转基因烟草的花药中特异性表达。构建了包含大豆热激启动子Gmhsp17.5C调控Cre重组酶基因,及水稻花药绒毡层特异性启动子Osg6B与Barnase基因之间带有阻断序列(两侧是loxp位点)的双元载体。在对转基因植株进行整株热激诱导处理后,通过植株花器官形态观察,花粉染色镜检,花粉萌发试验和结实率统计发现部分转基因烟草花丝明显缩短,花药萎缩,可育花粉很少,花粉大部分不能萌发,结实率相对于对照植株明显降低,育性表现为半不育或绝大部分不育。 3.利用已经建立的热激诱导定位重组系统调控RNA酶基因(Barnase基因)在转基因小麦的花药中特异性表达。我们构建了水稻花药特异性启动子Osg6B驱动Barnase基因组成型表达载体、热激调控Cre重组酶基因表达载体、水稻花药特异性启动子Osg6B与Barnase基因之间带有阻断序列(两侧是loxp位点)的载体、水稻花药特异性启动子Osg6B驱动Barnase抑制基因Barstar基因表达的载体。利用基因枪转化的方法转化小麦幼胚愈伤组织。经花粉染色镜检发现组成型表达Barnase基因的T0代转基因植株的花粉发生不同程度的败育。同时整合Cre重组酶基因和Barnase基因的部分T1代转基因植株经过热激诱导后大部分花粉败育。对同时整合Cre重组酶基因和Barnase基因的部分T1代转基因植株考种发现经过种子和幼芽热激诱导的转基因植株与未经热激诱导的同一株系的转基因植株以及未转基因植株相比结实率有微弱下降。4.利用铜诱导定位重组系统调控RNA酶基因(Barnas。基因)在转基因小麦的花药中特异性表达。我们构建了铜调控c邝重组酶基因表达的载体、水稻花药特异性启动子OsghB与刀口阴ase基因之间带有阻断序列(两侧是!。xP位点)的载体。利用基因枪转化的方法转化小麦幼胚愈伤组织。经花粉染色镜检发现同时赘合Cre重组酶基因和Ba,as。基因的部分T.代转基因植株经过铜诱导后(50 0 M CusO;)部分花粉败育。对同时整合Cre重组酶基因和刀口阴Qs。基因的部分T,代转基因植株结实率统计发现经过铜诱导处理的转基因植株比未经铜诱导的同一株系的转基因植株结实率有微弱下降。5.从拟南芥中克隆了与植物花粉形成相关的转录因子AtMYB103的启动子,并以G‘基因为报告基因转化烟草,组织化学染色结果证明:转基因烟草的花药和花粉都有转录因子AtMYB 103的表达,在花的其他组织未见表达。