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如同核酸和蛋白质,以寡糖和糖复合物(包括糖蛋白和糖脂)形式存在的糖类化合物也是发现于所有生命体的重要生物聚合物,它们在众多复杂生物过程中发挥着不可替代的重要作用。糖链形式的特定改变与特定的病理状态(例如癌症和炎症)紧密相关,这显示了糖链在临床诊断中的应用潜力,以及作为药物开发靶标的可能性。在人体中的重要糖链结构包括肿瘤相关糖抗原和ABH血型抗原等。糖结构的表达异常是肿瘤的表型标志之一。人们在肿瘤细胞上发现了几种常见的糖链结构,包括Tn抗原,T抗原,SLex抗原,Ley抗原,神经节苷脂(gangliosides),Globo-H和聚唾液酸(polysialic acid)等。这些异常糖链结构可以作为细胞癌变的诊断标记,也被研究开发形成抗肿瘤糖疫苗用于癌症免疫治疗。ABH血型系统是输血和器官移植医学中最为常见也最为重要的血型系统。ABH血型由红细胞等细胞表面的不同糖链结构决定,其糖抗原决定簇的结构为:GalNAcα1,3(Fucαl,2)-Gal(A抗原),Galα1,3(Fucα1,2)-Gal(B抗原)和Fucαl,2-Gal(H抗原)。获得结构均一的这些寡糖对研究它们的生物学功能和开发其在医药领域的应用是必需的。细菌细胞表面包裹着显著多样的多糖结构。其中一种主要的类型是O-多糖(也称为O-抗原,O-antigen)。O-多糖是细菌细胞表面脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的主要组成部分之一,它由多个拷贝(可以多达100个)的寡糖重复单元(O-unit)聚合而成。越来越多的证据表明O-多糖在细菌—宿主相互作用中扮演着重要角色,它们对病原菌在宿主中的有效定居以及抵抗补体介导的免疫反应发挥着不可或缺的作用。因此,对O-多糖生物合成过程的阐明有助于开发细菌相关疾病的治疗方法。自然界中糖链的生物合成由糖基转移酶催化。它们将相应糖核苷(糖基转移酶供体底物)上的特定单糖转移到一个糖基受体的特异羟基集团上形成糖苷键共价连接。因其在高效形成高空间特异性和立体化学特异性的糖苷键方面表现出的显然优势,糖基转移酶催化的糖链酶法合成已经成为化学合成糖链的有效替代途径。与哺乳动物中的糖基转移酶相比,来源于细菌的糖基转移酶常常更易于过量表达,获得可溶的高活性重组酶,而又不需要复杂的基因操作技术。另外,它们还常常具有广泛的底物适应性。因此,细菌糖基转移酶在酶法合成寡糖及其类似物上具有巨大的优势。还有很多细菌其细胞表面的糖链结构与哺乳动物细胞中的类似,因此,相应的糖基转移酶可以直接开发用于人体相关糖链的酶法合成。本论文的目标之一即是开发微生物来源的糖基转移酶用于寡糖的酶法合成。我们从大肠杆菌O-抗原生物合成基因簇中鉴定出了三个糖基转移酶,对它们的生化性质进行了研究。除了以揭示它们的底物适应性、酶的动力学性质和催化机理为目的的生化研究工作,本论文还通过岩藻糖基化寡糖和lacto-系列寡糖的小量合成实验验证了这些糖基转移酶在寡糖合成中的潜在应用价值。岩藻糖基化糖链结构在真核生物的多种生理和病理过程中发挥重要作用,这些过程包括组织发育、血管发生、受精作用、细胞粘连、炎症反应以及肿瘤转移等。虽然岩藻糖基化糖链结构在原核生物中没有在真核生物中那么普遍,但它们也参与病原菌的分子模拟,对宿主细胞结合和定居以及对宿主免疫反应的中和作用。在真核和原核生物中都存在的岩藻糖基转移酶(fucosyltransferase,FucT)负责岩藻糖基化反应,将岩藻糖苷从供体岩藻糖鸟苷酸二磷酸(guanosine-diphosphate fucose,GDP-Fuc)转移到各种受体分子上,这些受体分子可能为寡糖、糖蛋白或糖脂。我们鉴定和生化定性了两种微生物来源的α1,2-FucTs,并利用重组酶合成了两种岩藻糖基化寡糖。来源于Escherichia coli O128:B12的wbsJ基因编码一个负责在O-抗原重复单元半乳糖残基上添加α1,2-连接岩藻糖的α1,2-FucT。通过在蛋白N端融合谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST),WbsJ在E.coli BL21(DE3)中以融合蛋白的形式得到了过量表达。应用GST亲和层析和进一步的分子筛层析可以纯化得到组分均一的GST-WbsJ融合蛋白。使用各种受体底物进行的活性测定证明融合蛋白表现出广泛的底物特异性,对Galβ1,3GalNAc(T抗原),Galβ1,4Man和乳糖(Galβ1,4Glc)表现出较高的活性,对Galβ-O-Me和半乳糖的活性次之。一种天然二糖乳果糖(lactulose,Galβ1,4Fru)被发现是GST-WbsJ的最好底物,酶对其反应速度是对乳糖的四倍。动力学研究发现GST-WbsJ对乳糖比对乳果糖的亲和力强,其亲和常数Km分别为7.81mM和13.26 mM。但是,酶对乳糖的kcat/Km值(6.36 M-1·min-1)却只有对乳果糖的(13.39 M-1·min-1)一半左右。另外,研究发现GST-WbsJ的α1,2-FucT活性不依赖于Mn2+或Mg2+等二价金属离子。酶的活性还被GDP竞争性抑制,其抑制常数Ki为1.41mM。为研究WbsJ的高度保守功能域H152xR154R155xD157的功能,我们进行了点突变和GDP-bead结合实验。与对α1,6-FucTs进行的点突变实验结果不同,WbsJ在此功能域的突变子都没有完全丧失活性。但是,结果证明R154和D157残基在供体结合以及酶的催化活动中发挥至关重要的作用。H152和R155也对酶与GDP-Fuc的结合十分重要。实验结果同时暗示在α1,2-FucTs和α1,6-FucTs都存在的HxRRxD功能域在酶与底物结合与催化活动中的功能不尽相同。最后,以Galβ-O-Me和乳糖-β-N3为受体底物,使用重组纯化的融合蛋白成功合成了毫克级的岩藻糖基化寡糖。另一个细菌α1,2-FucT编码基因,wbwK,来源于E.coli O86,也以GST融合蛋白的形式进行了成功的表达和纯化。WbwK在非二价金属离子依赖性方面表现出与WbsJ相似的特性。但是,与WbsJ的广泛底物适应性不同,WbwK底物特异性非常严格,仅识别Galβ1,3GalNAcα-OBn(Me)(T-抗原衍生物)作为底物合成Ⅲ型H血型抗原,而对简单单糖底物半乳糖及其衍生物和其它寡糖底物没有活性。WbwK和WbsJ都能以T抗原为受体,只是受体底物广泛性不同。一种假说认为糖基转移酶序列中的高变区决定着其底物特异性。为验证此假说,我们对WbsJ和WbwK进行了高变区互换实验,结果形成六个嵌合体蛋白。尽管区域互换严重影响了酶的功能,使其中三个嵌合体丧失功能,另外三个嵌合体酶活也很低;但是三个具有酶活的嵌合体表现出广泛的底物特异性。这显示出高变区在决定受体底物适应性上的可能作用。糖基转移酶催化的糖基化反应需要以高能量的糖核苷为供体底物。特别的,FucT需要以GDP-Fuc为供体。GDP-Fuc在体内有两种合成途径,以GDP-甘露糖为起始物的从头合成途径,以及以岩藻糖、ATP和GTP为反应物的拯救途径。我们克隆并在大肠杆菌中过量表达了在细菌中负责GDP-Fuc拯救途径合成的双功能酶FKP,这是在细菌中目前发现的唯一的GDP-Fuc拯救合成途径。在体外反应中,FKP表现出GDP-Fuc合成功能,可以应用于GDP-Fuc的体外大量低成本合成。除此之外,利用毛细管电泳检测FKP反应还发现FKP具有广泛的底物适应性。实验的九种岩藻糖类似物中的七种被FKP以不同的反应活性转化生成相应的核苷供体。这为体外酶法合成岩藻糖基化寡糖类似物奠定了条件。为检验FKP在体内条件下的底物适应性并开发应用于多糖代谢改造,我们将其引入GDP-Fuc从头合成途径敲除的E.coli O86:B7菌株中。以岩藻糖类似物喂食这种GDP-Fuc合成途径工程化后的菌株时,岩藻糖类似物被细菌的多糖合成途径利用,最终整合到表面多糖结构中,从而实现了结构重塑多糖的体内合成。对重塑多糖进行的CE-MS检测证实了其结构。通过此方法引入细胞表面多糖的化学功能性集团,包括叠氮和氨基集团,可以通过体外选择性化学反应实现进一步修饰和荧光标记。这项研究提供了一种在多糖中引入结构修饰的简单而有效的方法。这一技术为多糖在生命过程中的功能研究和机理揭示提供了强大的工具。半乳糖残基在原核和真核生物的多种糖缀合物中广泛存在,并发挥重要作用。各种连接的半乳糖基结构是生命体中糖链高度多样性的重要表现形式。各种半乳糖基转移酶(galactosyltransferase,GalT)催化半乳糖基化反应,生成不同连接的糖苷键,包括α1,2-,α1,3-,α1,4-,α1,6-或β1,3-,β1,4-连接。乳-N-二糖1(lacto-N-biose I,Galβ1,3GlcNAc),即I型核心糖链,是人体中很多糖表位的组成部分,例如Lea,Leb和SLea抗原。Galβ1,3GlcNAc结构还存在于其它重要多糖,如乳-N-四糖(lacto-N-tetraose,LNT)中。我们由E.coli O55:H7的O-抗原合成基因簇中鉴定出一个β1,3-GalT编码基因,wbgO。WbgO以GST融合蛋白的形式进行了重组表达并通过GST亲和层析纯化得到比活力为67.5 mU mg-1的均一蛋白。其β1,3-GAlT活性通过放射性活性检测和对其合成的二糖产物的ESI-MS和NMR结构分析得到了验证。与GST的融合对其可溶性表达和有效纯化是必要的。融合蛋白在pH 6.0-8.0条件下表现较好催化活性,且最适pH值为7.0。另外,它还对缓冲体系具有偏好性,HEPES是用于实验的四个缓冲体系(包括HEPES,Tris-HCl,MES和柠檬酸钠)中最适合的。其活性依赖于特异的二价金属离子(Mn2+和Mg2+)。N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)以及以GlcNAc为非还原端的寡糖是其主要受体。但是,N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)以及以GalNAc为非还原端的寡糖也可以作为其受体。乳-N-三糖(lacto-N-triose,GlcNAcβ1,3Galβ1,4 Glcβ-OBn)是实验的所有受体中最好的。酶对底物动力学参数与底物特异性实验结果一致。最后,使用重组酶,以乳-N-三糖为受体成功合成了LNT寡糖。产物的结构通过ESI-MS和NMR分析得到了证实。TLC检测发现,重组酶可以实现受体底物的完全转化,显示出此酶作为寡糖合成工具酶的潜在应用价值。总之,本论文以三种糖基转移酶和一种糖核苷合成酶的生化定性为中心,提高了人们对细菌多糖合成相关酶类基础知识的认识,同时以此为基础为岩藻糖基化寡糖和LNT寡糖合成提供了一种替代途径,还建立一种细菌多糖修饰的新技术。