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研究背景:肺癌在全球癌症病例中上升最快,死亡率占癌症死亡数的19.4%,其中约80%的病例为非小细胞肺癌(NSCLC)。全球肺癌患者的5年生存率低,约4-17%,随着对肺癌进展分子机制的更深认识,分子靶向治疗已成为晚期肺癌的重要治疗手段。目前肺癌治疗方面的研究聚焦于:抗体靶向的免疫治疗(如PD-1)和驱动基因(如EGFR、K-RAS、ALK、MET、HER-2等)的分子靶向治疗。有研究表明,编码锚蛋白重复序列(ANKRD)的基因(如肿瘤抑制基因p16和p18)发生突变,如基因缺失、甲基化和点突变,可能会导致肿瘤的发生。锚蛋白重复序列(ANKRD),是自然界中广泛存在的蛋白质模式序列之一,由30-34氨基酸残基组成,其功能是介导蛋白质之间的相互作用,并参与转录调控、促进或抑制细胞周期、细胞发育分化等过程。在前期研究中,我们通过基因芯片检测5个NSCLC患者的肿瘤组织和癌旁组织,发现ANKRD29在肿瘤组织中表达明显增高,提示其可能是一种新型肿瘤相关基因。研究目的本课题拟在前期研究基础上,验证NSCLC患者肺癌组织和癌旁组织中ANKRD29的表达差异,进一步探索其与患者临床病理、预后的相关性,并初步对其细胞功能探索,从而揭示ANKRD29在NSCLC起病中可能的作用机制。方法1.根据入排标准,选取2012年11月至2015年10月在我院行肺癌根治术的40例肺癌患者(肺癌组织作为实验组,其癌旁组织作为自身对照组),通过RT-PCR检测两组标本ANKRD29 m RNA的表达量差异,分析其与患者临床病理、预后的相关性。2.在7种肺癌细胞系中筛选出ANKRD29 m RNA表达量最高及最低的各2种细胞系作为细胞实验研究对象3.通过MTT、单克隆形成、细胞划痕迁移实验,初步观察4种肺癌细胞系活性、增殖、迁移的差异。4.统计学方法:连续性资料如果满足正态分布采用(?)±s进行描述,组间比较采用独立样本t检验,配对资料采用配对样本t检验;如果不满足正态分布则采用中位数±四分位数间距描述,组间比较采用Wilcoxon秩和检验,配对样本比较采用符号检验。分类资料采用频数和百分比描述,组间比较采用卡方检验。预后分析采用ROC曲线分析、Kaplan Meire生存曲线分析,组间比较采用Log-rank检验。多因素分析采用Logistic回归(结局为二分类资料)和Cox回归(结局为生存资料)。采用SAS9.4软件进行统计分析,P<0.05认为差异有统计学意义。结果1、NSCLC患者的流行病学特征此研究纳入40位NSCLC患者(共入组47例,其中7例因临床随访资料缺失而删除),年龄59.3±9.3;男性26(65.0%)人,女性14(35.0%)人;吸烟19(47.5%)人,不吸烟21(52.5%)人;腺癌26(65.0%)人,鳞癌14(35.0%)人;TNM分期Ⅰ期15(37.5%)人,Ⅱ期15(37.5%)人,Ⅲ期10(25%)人。2、NSCLC患者肺癌组织与癌旁组织中ANKRD29 m RNA的表达量差异ANKRD29在肿瘤组织【相对表达量中位数为2.42(0.85,6.42)×10-2】中与癌旁组织【相对表达量中位数为1.59(0.48,5.14)×10-2】中表达差异有统计学意义(P=0.029)。3、ANKRD29 m RNA的表达量差异与NSCLC患者临床特征及预后的关系分析【根据ANKRD29在C/NC组织中的相对表达将样品按照Fold Change中位数0.603分为2组:高(≥0.603,n=20)和低(<0.603,n=20)】1)ANKRD29与NSCLC患者临床病理特征的关系分析两组ANKRD29表达差异与性别(p=0.507)、年龄(p=0.778)、吸烟史(p=0.752)、组织学类型(p=0.507)、TNM分期(p=0.138)、淋巴结转移(p=0.116)均无统计学意义(P>0.05),其中高表达组TNM III期、淋巴结转移N2占比高于低表达组,P值偏小,有待进一步扩大样本量研究。2)ANKRD29与NSCLC患者预后的关系分析KM曲线分析发现ANKRD29的表达量差异与预后没有统计学意义(P>0.05),但低表达组预后有优于高表达组的趋势。Cox回归显示Fold change与复发相关性无统计学意义(HR=1.030(0.970,1.093),P=0.338),Fold change与转移相关性无统计学意义(HR=1.000(0.935,1.069),P=0.998),Fold change与存活相关性无统计学意义(HR=1.038(0.968,1.113),P=0.298)。4、7种肺癌细胞系中ANKRD29m RNA水平的表达差异(以GAPDH作为内参)对7种肺癌细胞系的RT-PCR结果显示ANKRD29 m RNA相对表达量由高到低顺序如下:H1975(0.000535±0.0000486370)、Hcc827(0.000428391±0.0000399682)、H1650(0.000334±0.0000513799)、pc9(0.000057±0.0000066776)、A549 ddp(0.000036±0.0000036970)、A549(0.000029±0.0000046298)、H1299(0.000024±0.0000010194)。Hcc827、H1650、H1975细胞系与其他相比差异均有统计学意义(P<0.0001)。挑选表达量较高的Hcc827、H1975和较低的H1299、A549细胞系作为下一步实验对象。5、ANKRD29与4种肺癌细胞系细胞功能的相关性分析1)ANKRD29与4种肺癌细胞系迁移的相关性24小时,四种细胞之间两两比较差异具有统计学差异(P=0.001);48小时,四种细胞之间差异具有统计学差异(P=0.0014);72小时,四种细胞之间差异具有统计学差异(P=0.0005);96小时,四种细胞之间差异具有统计学差异(P=0.001)。2)ANKRD29与4种肺癌细胞系活性的相关性四种肺癌细胞系活性在0-5天并未表现明显差异。H1975与Hcc8细胞增殖差异无统计学意义(P=0.2194);H1975与A549细胞增殖差异无统计学意义(P=0.4936);H1975与H1299细胞增殖差异无统计学意义(P=0.2928);Hcc827与A549细胞增殖差异无统计学意义(P=0.2051);Hcc827与H1299细胞增殖差异无统计学意义(P=0.3955);H1299与A549细胞增殖差异无统计学意义(P=0.2804)。3)ANKRD29与4种肺癌细胞系增殖的相关性Hcc8与A549、H1975、H1299相比,增殖差异有明显统计学意义(P=0.0063);H1299、Hcc827、A549细胞两两比较,增殖差异无明显统计学意义(P=0.495)。结论1、NSCLC患者中ANKRD29 m RNA在肺癌组织中的表达量显著高于癌旁组织。2、ANKRD29在肺癌组织中的表达差异与性别、年龄、吸烟史、组织学类型、TNM分期、淋巴结转移未见明显相关性。3、高表达组淋巴结转移N2、TNM III期占比高于低表达组,P值偏小。4、ANKRD29 m RNA低表达组预后有优于高表达组的趋势。5、本研究提示ANKRD29可能是NSCLC的促癌基因之一,可能与肺癌细胞的迁移能力有相关性,还有待后续实验继续探索。