研究背景阿尔茨海默病(AD)是一种与年龄有关的神经退行性疾病。AD患者的主要临床表现是认知能力的逐渐丧失,其脑脊液(CSF)的主要特征为β淀粉样肽(Aβ)凝聚成淀粉样蛋白斑块并在脑实质区沉积,同时伴有磷酸化的tau蛋白水平升高。帕金森病(PD)也是一种与年龄有关的神经退行性疾病,但与AD不同,PD患者主要以动作迟缓、肢体僵硬、震颤为主要临床表现,这与黑质纹状体神经元随着病情进展而不断丢失以及脑结构改变有关。在临床症状方面,AD与PD具有重叠性。某些PD患者可能出现认知功能的损伤,甚至发展为痴呆,称为帕金森病痴呆。同时,某些AD患者也常伴有椎体外系统病变,表现为扭转痉挛、震颤麻痹以及各种行动失调等。三磷酸腺苷结合盒转运体 A1(adenosine triphosphate-binding cassette transporter A1,ABCA1)是由ABCA1基因翻译而成的蛋白。该转运蛋白在细胞内参与胆固醇的逆向运输,同时能够清除组织中多余的血脂,从而维持细胞内磷脂的稳态平衡。研究表明,在脑损伤修复的早期,ABCA1参与载脂蛋白E(ApoE)以及胶质细胞内胆固醇的调节。ABCA1能够加快Aβ的清除,并通过调节ApoA1来调节脑损伤修复,这一发现可能与AD的发病有关。单核苷酸多态性(SNPs)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸变异所引起的DNA序列多态性,是人类可遗传变异中最常见的一种。然而,目前仍然缺乏对于ABCA1 SNPs与AD或PD关系的研究。以往大部分研究的重点在于ABCA1对脂代谢的调节,尤其是对高密度脂蛋白(HDL),例如在Tangier病(TD),ABCA1促进HDL水平降低,同时影响巨噬细胞泡沫化过程。敲除小鼠的ABCA1可使低密度脂蛋白(LDL)水平降低,而甘油三酯(TG)水平升高,说明ABCA1在总胆固醇(TC)水平调节方面有重要作用。然而,以往的文献报道很少提及ABCA1 SNPs与脂代谢相关分子水平的关系,尤其是与AD和PD相关的生物标志。另一方面,虽然AD及PD患者的临床表现以及病理特征存在差异,但是,许多证据均表明,AD和PD发病过程中,患者脑内都存在慢性神经炎症。PD患者的CSF和基底神经节中的炎性因子水平普遍升高,例如白介素-1 β(IL-1 β)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等细胞因子,均参与促进AD患者脑内Aβ沉积。当中枢神经系统(CNS)受损或神经炎症发生时,血脑屏障(BBB)的通透性增强,外周循环中的细胞因子通过通透性高的BBB或没有BBB的区域进入CNS,从而引起CNS中炎性因子水平升高。虽然有研究证明了外周循环以及CNS中的炎性因子与AD和PD患者存在相关性,但目前尚无研究表明这些炎性因子能否作为AD和PD患者的生物标记,以及这些炎性因子的变化是否与ABCA1 SNPs有关。因此,我们的研究从分析AD和PD患者的ABCA1 R219K SNPs出发,比较AD患者、PD患者和健康人群中ABCA1 R219K SNPs的差异;通过检测患者外周循环载脂蛋白ApoA1、ApoA2和ApoB,脂代谢相关蛋白HDL、LDL、TC和TG,以及常见的炎性因子IL-1 β、IL-6和TNF-α水平,并分析其与AD和PD患者病情的相关性,从而为临床诊断及预防AD和PD提供一定的分子依据。第一部分ABCA1 R219K SNPs与AD和PD发病的相关性研究1.1目的通过分析ABCA1 R219K SNPs在AD和PD患者中的分布差异,探讨ABCA1 R219K SNPs与其发病及病程发展的相关性。1.2方法1.2.1研究对象所有患者和健康人群均为居住在我国内蒙古,且居住的时间超过20年的汉族人群;对所有研究对象的性别和年龄是否相匹配进行检测,同时排除神经活性物质及其他病变的影响。(1)AD患者:收集105例AD患者,使用简易精神状态检查(MMSE)、日常生活能力量表(ADL)和画钟实验(CDT),对其认知能力和日常生活能力进行评估和分析;使用Hachinski缺血量表(HIS),以鉴别AD和血管性痴呆(VD)。1.2.1.2 PD 患者(2)PD患者:收集116例PD患者,使用Hoehn-Yahr(H-Y)分量级表对PD患者的病情进行评估,然后使用MMSE、ADL和CDT对其认知能力和日常生活能力进行评估和分析。(3)健康人群:收集100位健康人群作为阴性对照(NC)组,使用MMSE、ADL和CDT对其认知能力和日常生活能力进行评估和分析,均排除认知障碍或神经系统疾病。1.2.2血液样本所有研究对象均在清晨接受空腹采血;血样保存于-28℃。1.2.3 基因分析提取全血DNA并进行纯度检测;使用聚合酶链式反应(PCR)技术对目标片段进行扩增;使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术对PCR产物进行SNPs检测。1.3 结果1.3.1人口学资料AD组、PD组和NC组三组之间的性别(X2=0.895,P=0.410)、年龄(X2=4.979,P=0.053)均无统计学差异。1.3.2各项评分(1)MMSE 评分:AD 组(16.59±1.52)低于 PD 组(25.60± 1.61)和 NC组(27.89±1.21),三组之间存在显著性差异(F=1728.886,P<0.001);PD组评分低于NC组,差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)ADL 评分:AD 组(39.41±2.51)和 PD 组(42.58±3.33)均高于 NC组(25.43±1.72),三组之间存在显著性差异(χx2=1242.562,P=0.004);AD组低于PD组,差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)CDT 评分:AD 组(1.90±0.72)和 PD 组(2.71±0.75)均低于 NC组(4.00±0.00),三组之间存在显著性差异(χ2=310.670,P<0.001);AD组低于PD组,差异具有统计学意义(P<0.05)。(4)HIS评分:AD组的平均评分为2.56±0.14,小于4分,确认为AD。(5)H-Y评分:PD组的平均评分为3.50±0.81,病情较为严重。1.3.3基因型分布的比较(1)哈迪-温伯格遗传平衡(Hardy-Weinberg equilibrium,HWE):ABCA1 R219K 基因型分布在 AD 组(χ2=0.086,P=0.769)和 NC 组(χ2=0.0482,P=0.826)均符合 HWE,PD 组(χ2=17.312,P<0.001)不符合 HWE。(2)R219K基因型分布:三组间具有统计学上的显著性差异(F=6.372,P=0.002);AD 组与 PD 组(P=0.012)、PD 组与 NC 组(P=0.001)之间具有统计学上的显著性差异,AD组与NC组(P=0.370)之间无差异。(3)R219K等位基因分布:AD组与PD组之间具有统计学上的显著性差异(P<0.05);AD组与NC组以及PD组与NC组之间无差异。(4)RR+RK、R219KKK基因型分布:两者在三组间具有显著的统计学差异(F=7.765,P=0.001),但AD组与PD组之间无差异;RR+RK在AD组(88.57%)和 PD 组(89.66%)均低于 NC 组(92.00%);KK 在 AD 组(11.43%)和 PD 组(10.34%)均高于 NC 组(8.00%)。(5)RR、RK+KK基因型分布:两者在三组间具有显著的统计学差异(F=6.372,P=0.002),但AD组与PD组之间无差异;RR在AD组(45.71%)低于PD 组(69.83%),PD 组高于 NC 组(53.00%);RK+KK 在 AD 组(54.29%)高于 PD 组(30.17%)(P=0.012),在 PD 组低于 NC 组(47.00%)(P=0.001)。1.3.4基因型分布与病情的关系(1)AD):在AD患者组,ABCA1 R219K基因型与MMSE评分呈负相关(r=-0.222,95%CI=-0.386～-0.033,P<0.05)。携带 R219K RR 基因型时,MMSE评分较高,病情发展较慢;而携带R219K RK或R219K KK基因型时,MMSE评分较低,病情发展较快。(2)PD:在PD患者组,ABCA1 R219K基因型与H-Y评分呈负相关(r=-0.489,95%CI=-0.624～-0.330,P<0.05)。携带 R219K RR 或 R219K RK 基因型时,H-Y评分较高,病情发展较快;而携带R219K KK基因型时,H-Y评分较低,病情发展较慢。1.4 结论ABCA1 R219K R等位基因是AD发病和病情发展的保护基因;ABCA1 R219K K等位基因是PD发病和病情发展的保护基因;AD患者和PD患者的ABCA1 R219K RR+RK基因型分布均显著低于健康人群;AD患者的ABCA1 R219K RK+KK基因型分布显著高于PD患者;PD患者的ABCA1 R219K RK+KK基因型分布显著低于健康人群。第二部分ABCA1 R219K SNPs与AD和PD血清学相关性研究2.1目的通过检测AD患者、PD患者和健康人群血清中ABCA1及相关因子的水平,并分析ABCA1 R219K SNPs与相关因子,以及AD、PD患者病情的关系,从而探讨ABCA1 R219K SNPs对于AD和PD患者血清因子的影响。2.2方法使用高速冷冻离心机分离血清,并使用酶联免疫法(ELISA)检测AD患者、PD 患者和健康人群 ABCA1、ApoA1、ApoA2、ApoB、HDL、LDL、TC、TG、IL-1β、IL-6和TNF-α的血清水平。2.3结果2.3.1血清因子水平在 AD 患者组,ABCA1、ApoA1、ApoA2、LDL、TC、TG 低于 NC 组,ApoB、HDL、IL-1β、IL-6、TNF-α 高于 NC 组,ABCA1、TC、IL-1β 低于 PD 患者,ApoA1、ApoA2、ApoB、HDL、IL-6、TNF-α 高于 PD 组;差异具有统计学意义(P<0.05)。在 PD 患者组,ApoA1、ApoA2、ApoB、HDL 低于 NC 组,ABCA1、IL-1β、IL-6、TNF-α高于NC组,差异具有统计学意义(P<0.05);LDL、TC、TG与NC组无显著差异。2.3.2基因型及其血清因子水平(1)KK或RR+RK:携带ABCA1 R219K KK基因型时,AD组与NC组血清 ABCA1、ApoA1、ApoB、HDL、TC、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平具有统计学上的显著性差异(P<0.05),而ApoA2、LDL、TG无差异;携带RR+RK基因型时,AD 组与 NC 组 ABCA1、ApoA1、ApoA2、ApoB、HDL、LDL、TC、TG、IL-1β、IL-6、TNF-α具有统计学上的显著性差异(P<0.05)。(2)RR 或 RK+KK:携带 ABCA1 R219K RR 或 RK+KK 基因型时,AD 组与 NC 组血清 ABCA1、ApoA1、ApoA2、ApoB、HDL、TC、IL-1β、IL-6、TNF-α水平具有统计学上的显著性差异(P<0.05),而LDL、TG无差异。(3)RR 或 RR+RK、KK 或 RK+KK:携带 ABCA1 R219K RR 或 RR+RK基因型时,PD 组与 NC 组血清 ABCA1、ApoA1、ApoA2、ApoB、HDL、IL-1β、IL-6、TNF-α水平具有统计学上的显著性差异(P<0.05),而LDL、TC、TG无差异;携带KK或RK+KK基因型时,PD组与NC组ApoA1、ApoA2、ApoB、HDL、IL-1β、IL-6、TNF-α水平具有统计学上的显著性差异(P<0.05),而ABCA1、LDL、TC、TG 无差异。2.3.3基因型与血清因子的相关性(1)AD患者组:血清ABCA1水平与ABCA1 R219K基因型呈负相关(r=-0.596,95%CI=-0.705～0.475,P=<0.05);携带 ABCA1 R219K RR 或 R219K RK基因型时,其血清ABCA1水平较高,携带R219K KK基因型时,其血清ABCA1水平较低。(2)PD患者组:血清HDL水平与ABCA1 R219K基因型呈正相关(r=0.692,95%CI=0.608-0.769,P<0.05);携带 R219K RR 或 R219KRK 基因型时,其血清HDL水平较低,携带R219K KK基因型时,其血清HDL水平较高。血清IL-1β(r=-0.394,95%CI=-0.558～-0.223,P<0.05)、IL-6(r=-0.448,95%CI=-0.595～0.290,P<0.05)以及 TNF-α(r=-0.516,95%CI=-0.633～-0.391,P<0.05)水平,与ABCA1 R219K基因型呈负相关;携带R219KRR或R219KRK基因型时,其血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平较高,携带R219K KK基因型时,其血清IL-1β、IL-6、TNF-α 水平较低。2.3.4 ABCA1与其他血清因子的相关性无论是AD组亦或是PD组,其血清ABCA1水平与血清ApoA1、ApoA2、ApoB、HDL、LDL、TC、TG、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平均不存在相关性。2.3.5病情与血清因子的相关性AD 组血清 IL-1β(r=-0.731,95%CI=-0.801～-0.650,P<0.05)、IL-6(r=-0.752,95%CI=-0.819～-0.670,P<0.05)和 TNF-α(r=-0.691,95%CI=-0.770～-0.600,P<0.05)水平与MMSE评分呈负相关;AD组MMSE评分越低即病情越严重时,其血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平越高。PD 组血清 HDL(r=-0.439,95%CI=-0.576～-0.297,P<0.05)水平与 H-Y评分呈负相关,而 IL-1β(r=0.849,95%CI=0.799～0.886,P<0.05)、IL-6(r=0.768,95%CI=0.696～0.828,P<0.05)和 TNF-α(r=0.851,95%CI=0.802～0.893,P<0.05)水平与H-Y评分呈正相关;PD组H-Y评分越高即病情越重时,其血清HDL水平越低,IL-1β、IL-6、TNF-α水平越高。2.4结论AD和PD患者的血脂相关因子和炎性因子的血清水平与健康人群存在显著性差异。AD 患者 ABCA1、ApoA1、ApoA2、ApoB、HDL、TC、IL-1β、IL-6、TNF-α与PD患者存在显著性差异;ABCA1 R219K R等位基因可能是引起AD患者ApoA2、LDL、TG以及PD患者ABCA1异常的因素;ABCA1 R219K K等位基因是AD患者ABCA1降低的危险基因;ABCA1 R219K R等位基因是PD患者HDL降低以及IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高的危险基因;AD和PD患者的血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平随着病情加重而升高;PD患者血清HDL水平随着病情加重而降低。