论文部分内容阅读
谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)属于硒蛋白家族,是生物体内重要的抗氧化酶之一,它可以消除体内的过氧化氢、脂质过氧化物等活性氧(ROS)物质,对于防治ROS引起的疾病,如动脉粥样硬化、辐射损伤、克山病和心血管疾病等有着巨大的药用价值。但长期以来,由于天然GPX存在不稳定(酶水解以及半衰期短)、来源有限、异源表达困难等诸多方面的缺陷,使得它的开发利用受到极大的限制。因而,对GPX的模拟以及开发治疗相关疾病的药物一直为国内外科学家所关注。我们从酶催化的本质(底物的识别、结合以及分子内催化)出发,利用超分子化学的原理与方法,选择主体分子——环糊精作为结合底物客体分子的骨架分子,构建了环糊精GPX模型体系。主要开展了以下工作:1.设计合成了三种具有GPX活性的2位碲桥联环糊精为了探究尺寸匹配效应对环糊精GPX模拟酶催化过程的重要性,我们选择以三种母体环糊精为模板,通过化学修饰在环糊精的次面引入催化基团碲构建了含碲环糊精GPX模型体系,并用三种不同结构的氢过氧化物,即过氧化氢(H2O2),叔丁基过氧化氢(t-BuOOH)和枯烯过氧化氢(CuOOH),考察含碲环糊精GPX模型体系的催化活性。研究结果发现:2位碲桥联γ-环糊精(2-Te-γ-CD)的催化活性最高,其催化GSH还原H2O2,t-BuOOH和CuOOH的活力分别是传统“小分子硒酶”Ebselen的80.5,333.3和118.3倍;含碲环糊精GPX模型体系对过氧化氢底物存在底物特异性,其中对CuOOH的结合最强,而对H2O2最差;通过考察三种模拟物催化GSH还原氢过氧化物反应的动力学,发现反应初速度对底物浓度的双倒数曲线为一组平行线,均表现出了米氏动力学特征,表明三种GPX模拟物以GSH为底物催化氢过氧化物的机理可能为乒乓机制,与天然酶的催化机理相似。2.研究了GPX模型2-Te-γ-CD的底物识别与催化机理首先利用UV-vis吸收光谱研究了GPX的2-Te-γ-CD与底物GSH的一个带有生色团的替代物——GSH-S-DNP相互作用的分子机制,结果表明2-Te-γ-CD能GSH-S-DNP形成化学计量比为1:1的复合物。其次,利用1H NMR技术研究了2-Te-γ-CD与底物GSH的相互作用机理。研究结果表明GSH与2-Te-γ-CD形成了化学计量比为1:2的复合物;(2-Te-γ-CD)2/GSH的复合常数显示它们的复合能力属于中等强度,正是这些中等强度复合中间体的存在大大地提高了2-Te-γ-CD的GPX活性,这一研究揭示了2-Te-γ-CD拥有较高GPX活性的本质机理。再者,利用电喷雾质谱(ESI-MS)及串联质谱技术(ESI-MS/MS),在线监控了2-TeCD催化GSH还原H2O2的反应过程。通过将微型反应器与ESI离子源直接相连,实现了在极短时间内对反应体系中间体的快速筛选,利用该技术成功地捕获了2-TeCD催化反应过程中的三个关键性中间体,并对其结构进行了详细的分析。研究结果表明,2-TeCD是通过碲醇、次碲酸、碲硫化物来展现其GPX活性,与天然GPX的催化机制类似。3.构建了基于γ-环糊精的GPX模型体系利用化学手段合成了7种基于γ-环糊精的GPx模拟物,采用元素分析、红外光谱、13CNMR和1H NMR等对它们的结构进行了详细表征。GPX活性研究表明6,6’双碲桥联γ-环糊精(6-diTe-γ-CD)的GPX活性最高,其催化GSH还原H2O2,t-BuOOH和CuOOH的活力分别是Ebselen的147.3,1897.9和663.9倍。对6-diTe-γ-CD的稳态动力学研究表明,其催化机制为乒乓机制,与天然酶遵循相同的催化机理。催化过程中双底物GSH和ROOH对6-diTe-γ-CD有竞争性亲和结合作用。4.开展了环糊精GPX模拟物保护线粒体抗氧化损伤研究线粒体是体内ROS产生的主要场所,因而我们建立了线粒体的Fe2+/Vc诱导损伤体系来研究GPX模拟物的生物学效应。研究结果证明了受氧化损伤后的线粒体发生如下变化:膨胀度异常增大、脂质过氧化产物——丙二醛(MDA)大量生成、细胞色素氧化酶活性下降。环糊精GPX模拟酶能不同程度的降低MDA的生成、抑制线粒体的膨胀,抑制细胞色素氧化酶活性的下降。其中,6-diTe-γ-CD和2-Te-γ-CD保护线粒体免遭ROS损伤的能力强于其他GPX模拟酶及传统小分子硒酶“Ebselen”,因此有望成为治疗心血管疾病的新药前体化合物。