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目的IV型胶原蛋白为肾小球基底膜中的支架结构,在肾小球滤过屏障功能中起着至关重要的作用,其中3个Ⅳ型胶原基因(COL4A3,COL4A4和COL4A5)突变可造成一组临床表现、病理特征及遗传类型异质性的肾脏疾病,其疾病谱包括Alport综合征(AS)、良性家族血尿(BFH)和局灶节段性肾小球硬化(FSGS)。因这3个基因外显子较多且无热点突变,利用传统的PCR及Sanger测序方法进行基因突变检测效率较低且工作量巨大。本研究首先针对性地建立基于靶序列捕获联合高通量测序的遗传性肾病基因诊断体系,并利用此体系开展IV型胶原相关肾病的临床应用研究,探索IV型胶原相关肾病COL4A3,COL4A4及COL4A5基因的突变类型,总结基因型和临床表型的关系,进一步结合临床表型、病理特征和基因检测结果探讨IV型胶原基因突变与AS、BFH和FSGS的关系,为基因诊断、遗传咨询和产前诊断的研究提供依据。方法收集24个Ⅳ型胶原相关肾病家系,提取患者及家系成员基因组DNA。首先对所有先证者进行序列捕获高通量二代测序(NGS)分析,采用标准流程进行目标序列的捕获与富集、测序文库的准备、上机测序以及序列比对。分析流程中使用的对照人群数据库包括千人数据库(http://www.1000genomes.org)、dbSNP数据库以及包含2087个正常人的华大内部数据库。应用Phylop(phyloP46wayPlacental)软件用评估碱基位点保守度、PolyPhen-2(Polymorphism Phenotyping v2.2.5)和SIFT algorithm(Sorting Intolerant FromTolerant v5.1)软件预测错义变异对蛋白质功能的影响、HSF(http://ud.be/HSF3)算法预测剪切位点变异对基因转录功能的影响。根据检测到的特定变异设计特异引物,应用Sanger测序及qPCR方法验证NGS发现的点突变和拷贝数变异。同时对血、尿液、肾脏病理及基因检测结果进行分析。结果1.利用建立的基于靶序列捕获联合高通量测序的基因诊断体系,我们在21例AS,2例BFH,1例FSGS患者中检出29个基因突变,其中23个为新的突变。这些新的突变中,有4个位于COL4A3基因上,7个位于COL4A4基因上,12个位于COL4A5基因上。2.21例AS患者中检出22个点突变和2个片段缺失,22个点突变包括16个错义突变、1个无义突变、4个移码突变和1个5’UTR突变。16(16/21,76%)例患者显示为X连锁遗传(突变位于COL4A5基因上),4例患者(4/21,19%)显示为常染色体隐性遗传(COL4A3和COL4A4纯合突变或复合杂合突变),1例患者(1/21,5%)显示为常染色体显性遗传(COL4A3或COL4A4杂合突变)。通过分析COL4A5基因型和临床表型关系,我们发现COL4A5基因上发生甘氨酸置换突变患者中,被酸性氨基酸置换的患者的临床表型要比被中性氨基酸置换的患者的临床表型更为严重。3.COL4A4 c.1536dupG,COL4A4 c.622G>C和COL4A4 c.4844C[2]杂合突变可分别造成ADAS,BFH和FSGS,经过生物信息学分析和家系验证,这些新的致病突变分别和疾病共分离。4.COL4A4 c.622G>C单基因杂合突变和COL4A4 c.1471C>T,COL4A3 c.3418+1G>T双基因顺式突变均能造成良性家族血尿。结论1.基于靶序列捕获联合高通量二代测序技术建立的遗传性肾病基因检测体系可高效、精准、快速地对IV型胶原相关肾病患者进行基因检测。我们共检测出23个新的突变,扩大了IV型胶原相关肾脏疾病基因突变谱,并从一定程度上解释了AS临床表型异质性的原因,为基因诊断、遗传咨询和产前诊断研究提供依据。2.通过分析临床、病理及基因检测结果,我们发现COL4A4杂合突变造成的ADAS、BFH和FSGS是Ⅳ型胶原相关肾脏疾病的亚型,很可能为疾病进展过程中的不同阶段,为进一步研究Ⅳ型胶原相关肾脏疾病的发病机制、治疗及转归提供线索。3.COL4A3和COL4A4单基因杂合突变或双基因顺式突变均能造成良性家族血尿,通过此研究我们丰富了良性家族血尿双基因遗传方式。