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纤维素酶是一组复合酶的统称,主要包括内切葡聚糖酶（endo-glucanase）,纤维二糖水解酶（cellobihydrolase）和β-葡萄糖苷酶（β-1,4-glucosidase）,这三种酶协同作用将纤维素转化成葡萄糖。近年来随着纤维素酶在棉织品水洗整理工艺及洗涤剂工业中的成功应用,细菌纤维素酶制剂已显示出良好的使用性能和巨大的经济价值。本文利用基因工程实现了枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）来源的内切葡聚糖酶基因在毕赤酵母的高效表达,同时利用蛋白质工程手段对内切葡聚糖酶基因进行了重构研究。1.根据枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）内切葡聚糖酶基因序列设计引物,采用PCR扩增到获得去除信号肽后约1.4 kb的内切葡聚糖酶基因片段。以此片段成功地构建了pPIC9k-End载体,并转化至巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115。经过MD、MM平板筛选和酶活性测定,获得了高效表达的转化子GS115-EndⅠ、GS111-EndⅦ和GS115-EndⅧ。在摇瓶培养条件下,对酵母工程菌表达条件进行了优化研究:在pH 4～8条件下均能稳定表达,诱导起始OD600=5表达水平最高,甲醇诱导最佳浓度为0.5%～1.0%,于250 mL以上摇瓶培养对表达有显著的促进作用。三株工程菌在优化条件后诱导培养,酶活性可达860.7、760.3和786.2 U/mL,分别为原始菌株酶活性（63.78 U/mL）的13.5、11.9和12.3倍。SDS-PAGE分析表明,表达产物分子量约为79.82 kD,热稳定性分析表明该酶在65℃保温30 min可保持最高酶活力的80%左右。2.大部分已知序列的纤维素酶主要由纤维素酶结构域（cellulase domain,CD）,糖结合模块（carbohydrate-binding module,CBM）以及连接两者的连接肽（linker）组成的多结构域蛋白。本实验构建了增加纤维素酶结构域、糖结合模块以及删除糖结合模块的内切葡聚糖重构酶基因,并连接pPIC9k表达载体以构建pPIC9k/EG-2、pPIC9k/EG-3和pPIC9k/EG-4重组载体。将重组载体转化巴斯德毕赤酵母GS115后,诱导表达测定比较其酶活力以分析结构域在内切葡聚糖酶中的作用。结果表明增加催化域反而降低了内切葡聚糖酶的酶活,可能是大结构催化结构域的增加影响了该酶的完整拓扑结构,改变了催化域和连接肽的夹角,最终影响了内切葡聚糖酶的活性部位与底物的作用。3种重构酶的酶学性质测定表明删除糖结合模块后内切葡聚糖酶在最适温度（65℃）下可保持全部酶活,但在较低温度（50℃以下）条件下酶活性表现出明显降低。40℃条件下测定酶活性,仅为最高酶活力的46.7%,而未改造的内切葡聚糖酶可保持最高酶活力的80%以上。糖结合模块具有非水解性破坏纤维素结构使之更适合内切葡聚糖酶的作用,而65℃以上温度条件预处理底物也具有类似作用,以至于糖结合模块只在低温反应条件下作用明显。