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高效液相色谱法(HPLC)是目前应用最为广泛的高效液相分离技术之一,具有简便、高效、快速、灵敏、样品用量少、应用范围广等特点。本文在简单综述了近十年来高效液相色谱在微生物发酵产物分离分析中的应用基础上,完成了以下工作:
1、针对现有血竭中龙血素A和龙血素B的测定一般采用常规高效液相色谱法,分析时间长、柱效低的问题,在优化了流动相组成与流速基础上,建立了一个测定天然血竭与人工诱导形成的血竭样品中龙血素A和龙血素B的超高效液相色谱法。结果表明,以WatersAcquityUPLCBEHC18柱(2.1×50mm,1.7μm)为色谱柱,乙腈—水(29:71,v/v)为流动相,在流速为0.3mL/miN,检测波长为210nm,进样量为2μL,柱温为40℃的条件下,龙血素A和龙血素B能够在10min内实现基线分离。该方法可以用于天然血竭和人工诱导血竭样品的测定,回收率在91%-206%之间。
2、虫草素、尿嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、鸟苷和腺苷是冬虫夏草中重要的碱基类化合物,但有关冬虫夏草中这几个碱基类化合物的高效液相色谱同时分离分析研究还未见文献报道。本文在对流动相组成、梯度洗脱程序及流速进行优化后,以甲醇—水为流动相,采用梯度洗脱方式,选择流速为0.1mL/miN,检测波长为260nm,进样为3μL,柱温为30℃,建立了一个能在10min内同时分离测定尿嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、鸟苷、腺苷和虫草素的超高效液相色谱法。将该方法用于人工冬虫夏草菌丝体中这几个碱基类化合物的测定,结果表明,该方法简便、快速、灵敏度高、重现性好,具有实际应用价值。
3、赤霉素、6—糠氨基嘌呤和3-吲哚乙酸是三种广谱性植物生长调节剂,但对于发酵液和菌体中这三种组分的HPLC同时分离测定还未见文献报道。本文在优化了流动相组成、流速及柱温等色谱条件后,采用WatersC18色谱柱(4.6×250mm,5μm)为色谱柱,甲醇—水(含0.2%冰醋酸和0.1%四氢呋喃)(35:65,v/v)为流动相,在流速为1.0mL/miN,柱温为30℃,进样量为10.0μL,检测波长为210nm的条件下,建立了一个同时分离测定赤霉素、6—糠氨基嘌呤和3-吲哚乙酸的高效液相色谱方法。该方法可以在20分钟内实现发酵液和菌体中这三种组分的同时分离测定,具有简单、准确、实用性强的特点。
4、为了研究人工诱导血竭的抗氧化性,一是利用Fenton反应产生的·OH对酸性铬兰K具有氧化褪色作用,在详细优化了反应条件后,建立了一个未见文献报道的测定·OH的光度分析方法,并用硫脲、甘露醇验证了方法的应用性;二是优化了光度法测定DPPH·的实验条件,建立了一个评价药物抗氧化活性的DPPH·光度分析方法,并用芦丁和BHA验证了方法的应用性;三是采用所建立的·OH和DPPH·光度测定方法,研究了几种天然来源与人工诱导形成的血竭甲醇提取物的抗氧化活性。结果表明,天然来源与人工诱导形成的血竭具有类似的抗氧化活性,人工诱导形成的血竭具有替代天然血竭的应用前景。