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目的构建绿色荧光蛋白(GFP)标识的水通道蛋白-4(AQP4)及其突变体示踪系统,利用激光共聚焦技术,建立表达AQP4及其突变体的大鼠星形胶质细胞水通透性的评价系统,并利用该系统探讨精氨酸加压素(AVP)对AQP4水通透性的调控及信号转导机制。方法依据大鼠AQP4-M23的cDNA序列和质粒pEGFP-C1多克隆位点(MCS)的特点设计引入合适的内切酶序列的引物,通过RT-PCR法获取AQP4-M23的DNA序列,凝胶电泳鉴定；利用pMD(?)20-T克隆载体通过T-A克隆扩增AQP4-M23,并进行基因测序鉴定；酶切T-A克隆所得AQP4-M23与pEGFP-C1质粒进行连接反应,完成pEGFP-C1-AQP4-M23的构建,鉴定正确后,扩增、提取纯化融合质粒。设计将AQP4-M23的第111位和180位的丝氨酸突变为丙氨酸的引物对,利用Muta-directTM定点突变试剂盒通过PCR技术使特定位点突变,构建pEGFP-C 1-S111A-AQP4-M23釉pEGFP-C 1-S180A-AQP4-M23两种含突变位点的融合质粒。水通透性测定：依据优化实验结果,将构建的融合质粒瞬时转染不表达AQP4的CTX-TNA2星形胶质细胞,37℃、5%CO2、完全培养基培养24h使目的蛋白表达。利用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)成像技术记录GFP荧光图像,以确定细胞表达与不表达目的蛋白,然后记录不同干预条件下,钙黄绿素荧光强度的变化,利用LSCM的脱机图像分析软件LAS AF Lite和免费图像处理软件Image J 1.42对脱机图像进行处理,分析GFP在细胞上的分布,观察V1aR激动剂Arg8-Vasoticin对AQP4定位的影响。选择表达目的蛋白的细胞及其周围不表达目的蛋白的细胞作为观察对象,分析换低渗环境前后不同时间点和不同干预条件下Calcein荧光强度的变化,取PBS由等渗液到换成低渗液即刻及其后10s内的荧光变化曲线作为分析对象,计算荧光强度随时间变化的速度,即时间导数τ,代表细胞水肿的速度,本实验中以-τ代表细胞膜对水的通透性的大小,以判断不同干预条件下AQP4-M23及其突变体对水的通透性。结果1基于GFP标识的AQP4-M23及其突变体示踪系统的建立以SD大鼠脑组织总RNA为模板,利用自行设计的包含相应酶切位点序列的引物进行RT-PCR扩增AQP4-M23产物的凝胶电泳凝胶见大小正确的条带,T-A克隆扩增目的基因后测序,比对基因测序结果和基因库数据可见测序图中序号为24-929的碱基共计906个碱基和AQP4-M23序列完全一致,并在序列前后正确引入了内切酶HindⅢ和XbaⅠ酶切位点的序列,通过RT-PCR技术准确获取了AQP4-M23全长序列。利用基因重组技术连接真核表达质粒pEGFP-C1和所获得的含有合适酶切位点的AQP4-M23序列后,酶切证实目的基因(AQP4-M23)以正确方式插入质粒pEGFP-C1的MCS中。以融合质粒pEGFP-C1-AQP4-M23为模板,设计引物改变相应突变位点碱基通过PCR技术分别实现S111和S180。两个氨基酸残基对应碱基的突变,基因测序图谱分别示S111对应的碱基AGC突变为GCC、S180对应的碱基TCC突变为GCC。RT-PCR证实,CTX-TNA2星形胶质细胞系不表达内源性AQP4。LSCM扫描结果示,GFP标记于AQP4-M23的氨基端,不影响AQP4-M23定位在胞膜上,融合蛋白在细胞膜上表达,均匀分布,胞浆内仅痕量表达；S111和S180突变为丙氨酸后不影响突变体在细胞膜上的定位。下调仪器增益可消除GFP的荧光对钙黄绿素荧光强度测量的影响。表达了GFP标记的AQP4-M23的CTX-TNA2细胞,随蛋白表达量的增加,细胞膜对水的通透性增加,GFP荧光强度增加到一定程度后,进一步增加时,细胞膜对水的通透性未出现明显增加。2 AVP对AQP4-M23水通透性的影响本实验中Arg8-vasotocin未改变转染了pEGFP-C1-AQP4-M23融合质粒的CTX-TNA2星形胶质细胞GFP荧光强度及其在细胞膜及胞浆内分布。表达AQP4-M23的CTX-TNA2细胞对水的通透性明显增加,达5倍左右(P<0.01)；Arg8-vasotocin对不表达AQP4-M23的CTX-TNA2细胞对水的通透性无影响(P>0.05); Arg8-vasotocin处理使表达AQP4-M23的CTX-TNA2细胞对的水通透性进一步增加(P<0.01)；在Arg8-vasotocin处理前先加CaMKⅡ抑制剂KN-62预处理,可阻断Arg8-vasotocin的这种作用,在Arg8-vasotocin处理前先加PKC抑制剂BISI预处理,使表达AQP4-M23的CTX-TNA2细胞对的水通透性略有增加,但无统计学意义(P>0.05)。3 S111突变对AQP4-M23水通透性及AVP干预的影响和表达了AQP4-M23的CTX-TNA2细胞相比,AQP4-M23第111位的丝氨酸突变为丙氨酸后对水的通透性没有明显的影响；Arg8-vasotocin处理不能使表达S111A-AQP4-M23的CTX-TNA2细胞对的水通透性进一步增加,BISI预处理对表达S111A-AQP4-M23的CTX-TNA2细胞对水的通透性无明显影响(P>0.05)。4 S180突变对AQP4-M23水通透性及AVP干预的影响和表达了AQP4-M23的CTX-TNA2细胞相比,AQP4-M23第180位的丝氨酸突变为丙氨酸后对水的通透性没有明显的影响；Arg8-vasotocin处理仍可使表达S180A-AQP4-M23的CTX-TNA2细胞对的水通透性进一步增加(P<0.01),KN-62预处理仍可阻断Arg8-vasotocin的这种作用(P<0.05)。结论本实验成功构建GFP标识的AQP4及其突变体示踪系统,建立了表达AQP4及其突变体的大鼠星形胶质细胞水通透性的评价系统,AQP4可使星形胶质细胞对水的通透性明显增加,AVP可通过激活V1aR增加AQP4对水的通透性,直接或间接通过CaMKⅡ作用于AQP4的111位的丝氨酸是其可能的作用途径。