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随着医药、食品、精细化工等行业对光学纯手性中间体需求的不断增长,人们已经充分意识到手性化合物的重要性。酶法生物催化生成手性化合物因其具有独特优势而成为国内外研究热点。因而进一步研究该转化过程的酶反应机制,酶分离纯化及酶学性质研究,具有非常重要的理论价值和现实意义。本文从实验室保藏的三株前期构建的重组大肠杆菌进行摇瓶培养,筛选出酶活最高的E.coli BL21(pET30a-cr318)。通过摇瓶培养,发酵罐高密度培养,大量获得该酶,并在此基础上进行酶学性质和催化机理研究。(1)经过对重组大肠杆菌E. coli BL21 (pET30a-cr318)摇瓶培养的研究,得到优化后的培养条件和诱导条件。优化后培养基组成：葡萄糖1%,蛋白胨1.5%,酵母粉0.5%,pH=7.5,微量元素浓度1 mL/L。优化后培养条件：摇瓶装液量50 mL/250 mL,接种量5%。诱导条件：诱导时间2 h,诱导温度28℃,诱导后发酵时间8 h,诱导剂浓度1 mmol/L。在优化培养基和培养条件下培养该重组菌,比酶活为0.78 U/mg,是未优化前的1.6倍。(2)在15 L发酵罐中对重组菌E.coli BL21(pET30a-cr318)进行扩大培养,并且建立分批发酵动力学模型。在分批发酵基础上再用pH-stat补料分批发酵,最大菌体密度达到22.7 g/L(DCW),是分批发酵的2.15倍；酶活为39.34U/mL,是分批发酵的3.7倍。(3)对高压破胞和超声破胞两种破胞工艺进行优化和比较。高压破胞优化后的工艺条件：破碎时间6 min,菌体浓度0.083 g/mL,破胞得到的酶活0.65 U/mg,破胞率97.5%。超声破胞的优化工艺条件：功率900 W,破碎时间12min,菌体浓度为0.083 g/mL,得到的酶活0.48 U/mg,破胞率82.3%,分别是高压破胞的74%和84%。(4)羰基还原酶经镍柱层析纯化后酶活提高8.64倍,但酶活回收率只有58.3%。 SDA-PAGE电泳显示该羰基还原酶的亚基分子量为30 kDa。探究镍柱层析纯化后羰基还原酶的酶学性质,其酶学性质如下：羰基还原酶是NADPH依赖型酶；最适反应温度为35℃,温度超过35℃后酶活低于最高酶活的60%；最适反应pH为7.0,pH稳定范围为5.5～7.5；K+、Ca2+、Na+和Mn2+对酶有激活作用,EDTA使酶活降低；加入有机溶剂均能降低羰基还原酶的酶活,在乙醇中相对稳定,但在吡啶、乙腈和四氢呋喃中都极度不稳定。(5)研究羰基还原酶酶催反应动力学后发现羰基还原酶催化反应机制是顺序型序列反应机制。NADPH的表观米氏常数Km为10.21 mmol/L, ATS-6[(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯]的表观米氏常数Km为1.52mmol/L。利用羰基还原酶对底物ATS-6进行转化进程测定,在反应4h后达到平衡,d.e.值保持在100%,且最终产率可达94%,表明酶促转化的时间较短且d.e.值高。