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研究背景:近年来研究显示,无论是中枢神经系统慢性退行性疾病,比如阿尔兹海默症（AD）、帕金森综合征（PD）、多发性硬化症（MS）,还是急性创伤性脑损伤（TBI）等非感染性神经系统疾病都伴有S100A9升高,同时伴有星形胶质细胞活化,两者可能共同参与了多种中枢神经系统疾病的发生发展。星形胶质细胞是中枢神经系统中最主要的胶质细胞,病理条件下如创伤、感染、炎症反应等都会诱发星形胶质细胞A1型活化,损害中枢神经系统。S100A9是一种促炎因子,也被称为损伤相关分子模式（DAMP）,在多种中枢神经系统疾病中高表达。课题组前期结果显示S100A9不仅能促进Aβ聚合成寡聚体和纤维状类老年斑结构,也能促进SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞凋亡。目的:通过体内实验检测尚未出现行为学改变的早期APP/PS1转基因AD小鼠脑组织S100A9蛋白的表达量和A1型星形胶质细胞的活化情况,体外实验检测S100A9对星形胶质细胞的作用进而影响神经元的存活,探讨S100A9在神经退行性疾病中的可能作用及潜在机制。本研究分为两个部分第一部分:S100A9通过TLR4/NF-κB信号通路活化小鼠星形胶质细胞方法:选用4月龄的APP/PS1转基因AD小鼠,利用RT-q PCR法检测AD小鼠脑组织中GFAP、C3、S100A9 m RNA表达水平。提取C57BL/6小鼠的星形胶质细胞,使用0-500μg/m LS100A9刺激细胞24 h。CCK-8检测细胞的增殖能力,划痕实验检测细胞迁移能力,收集细胞进行转录组测序及生物信息学分析,RT-q PCR检测细胞GFAP和C3m RNA转录水平,ELISA检测细胞培养上清中IL-6和TNF-α蛋白水平。利用细胞转录组测序筛选出TLR4/NF-κB信号通路,Western Blot验证通路中TLR4、MYD88、P65和PP65蛋白表达水平;使用TLR4抑制剂TAK-242,RAGE受体抑制剂FPS-ZM1,NF-κB抑制剂BAY11-7082作用细胞,检测细胞表达活化标志物和炎症因子的水平。结果:4月龄AD小鼠脑组织大量表达S100A9（p＜0.01）,且存在大量被激活的A1型星形胶质细胞。S100A9与活化标志物升高的趋势一致,提示S100A9可能对星形胶质细胞激活起作用。与对照组相比,5μg/m L S100A9对星形胶质细胞有明显的促进增殖和迁移的作用（p＜0.01）。S100A9可以显著上调星形胶质细胞活化标志物GFAP、C3、Steap4、H2-T23、H2-D1、Psmb8、Lcn2、Timp1、Cxcl10、Gbp2,炎症因子IL-6、TNF-α,趋化因子Cxcl1、Cxcl10、Ccl2、Ccl3、Ccl4、Ccl5的表达水平（p＜0.01）。S100A9刺激后的星形胶质细胞高表达TLR4、MYD88、P65和PP65蛋白（p＜0.01）。使用TLR4抑制剂和NF-κB抑制剂可以明显逆转星形胶质细胞活化状态,减少细胞产生炎症因子（p＜0.01）。结论:AD早期脑组织高表达S100A9蛋白,且存在大量被激活的A1型星形胶质细胞。异常升高的S100A9活化星形胶质细胞,并促进细胞释放炎症因子。第二部分:S100A9上调星形胶质细胞胞外谷氨酸促进神经元损伤方法:本部分采用Amplite荧光法检测星形胶质细胞上清中的谷氨酸浓度,使用TAK-242、FPS-ZM1和BAY11-7082作用细胞30 min后加入S100A9,检测星形胶质细胞表达谷氨酸转运体GLT-1和胞内钙离子的水平。我们还深入探讨了S100A9和S100A9激活的星形胶质细胞条件培养基（CM）对神经元凋亡和细胞存活的影响。提取C57BL/6小鼠神经元,使用原位末端转移酶标记技术检测S100A9组和S100A9 CM组神经元的凋亡率,使用CCK-8细胞计数试剂盒检测细胞存活率。结果:S100A9刺激星形胶质细胞后,上清谷氨酸浓度显著升高（p＜0.01）。与对照组相比,S100A9刺激细胞后显著下调谷氨酸转运体GLT-1 m RNA和蛋白水平及上调胞内钙离子（p＜0.001）。S100A9和S100A9激活的星形胶质细胞条件培养基（CM）均导致神经元凋亡,细胞存活率降低,这在CM处理的情况下凋亡更为严重（p＜0.01）;然而通过抑制NF-κB,CM组的神经元细胞凋亡明显减轻（p＜0.01）,细胞存活率有所升高（p＜0.01）。结论:S100A9可能通过TLR4/NF-κB信号通路激活星形胶质细胞,诱导星形胶质细胞减少谷氨酸摄取及增加谷氨酸释放,进一步加剧神经元损伤。